纤维素酶

张晓静2013.02纤维素酶一、纤维素酶特性及来源二、纤维素酶的生产三、纤维素酶的应用张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源•分布•化学组成纤维素纤维素酶纤维素酶的来源•定义•酶系组成•来源•工业菌种张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源纤维素占植物干重的35％～50％，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。纤维素的化学组成十分简单，是由β-D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的线形结晶高聚物，其聚合度很大，通常由4000～8000个葡萄糖分子串联起来，分子质量达200～2000kD。纤维素张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。目前普遍认为纤维素酶系主要包括以下三类酶组分。(1)内切葡聚糖酶(endoglucanase，EG，E.C.3.2.1.4)(2)外切葡聚糖酶(CBH，E.C.3.2.1.91)(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，E.C.3.2.1.21)纤维素酶张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源(1)内切葡聚糖酶(EG，E.C.3.2.1.4)系统命名为1,4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，也称Cx酶。在纤维素的水解过程中，首先由EG从纤维素中部的无定形区进行随机切割，降低纤维素的聚合度，产生大量的小分子纤维素。EG作用于较长的纤维素链，对末端键的敏感性比中间键小，但它不能单独作用于结晶纤维素，只作用于纤维素无定形区或溶解性的纤维素衍生物以及酸膨胀等预处理的纤维素。纤维素酶张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源(2)外切葡聚糖酶(CBH，E.C.3.2.1.91)系统命名为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，简称纤维二糖水解酶(CBH)，也称C1酶。CBH能从EG作用后的纤维素分子的非还原端(如里氏木霉的CBHⅡ)或者还原端(如里氏木霉的CBHⅠ)依次切下纤维二糖单位。其单独作用于天然结晶纤维素时酶活力较低，但在EG酶的协同作用下，可以彻底水解结晶纤维素。纤维素酶张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21，BG)又称为纤维二糖酶(cellobiase，CB)。CB能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，它对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加，水解速度下降。酶解纤维素时，对无定形区仅EG即可使之水解，对于结晶区则需要有EG和CBH的协同作用，而且在结晶纤维素糖化过程中CB组分会使这种协同作用大大加强。纤维素酶张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源对于天然结晶纤维素的水解，首先需要EG酶随机水解切断无定形区的纤维素分子链，使结晶纤维素出现更多的纤维素分子基端，为CBH酶水解创造条件，然后CBH酶作用于纤维素末端基释放出纤维二糖，纤维二糖再由CB酶水解成葡萄糖，在上述三类酶的协同作用下完成对纤维素的降解。因此，纤维素的完全降解有赖于这三类酶的合适的比例，比例不当时会显著影响它们对纤维素的降解活力。纤维素酶张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源纤维素酶来源非常广泛，昆虫、软体动物、微生物(细菌、放线菌、真菌等)都能产生纤维素酶，如白蚁、小龙虾等能产生完全不同于其内共生微生物群所产的纤维素酶，反刍动物的瘤胃微生物也拥有强大的纤维素降解酶系。微生物发酵方法是纤维素酶大规模生产最有效途径。纤维素酶来源张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的降解能力也大不相同。放线菌的纤维素酶产量极低，研究很少。细菌的产量也不高，且主要是内切葡聚糖酶，大多数细菌所产纤维素酶对结晶纤维素没有活性，另外，所产生的酶是胞内酶或吸附于细胞壁上，很少能分泌到细胞外，增加提取纯化难度，在工业上很少应用。而丝状真菌具有产酶的诸多优点。纤维素酶来源张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源丝状真菌具有产酶的诸多优点：产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。从纤维素酶工业化制备及其应用角度看，研究和采用丝状真菌产酶具有更大意义。纤维素酶来源张晓静2013.02一、纤维素酶的特性及来源目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种大多都是丝状真菌，其中产酶活力较强的菌种为木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，特别是里氏木霉(Trichodermareesei)及其近缘菌株较为典型，它遗传性状稳定、具有较好的抗代谢阻遏能力而产酶活力高、其纤维素酶系完全、生长环境粗放、酶易提取、且菌株安全无毒。•里氏木霉被公认为是最具有工业应用价值的纤维素酶生产菌。纤维素酶来源张晓静2013.02二、纤维素酶的生产纤维素酶的生产通常采用固态发酵和液体深层发酵两种工艺。无论采用何种工艺，我国纤维素酶生产菌种大多都采用经诱变或经基因改性的里氏木霉菌株，只有少数企业采用康氏木霉、黑曲霉或者青霉作为生产菌种。下面就以里氏木霉为例，简要介绍纤维素酶的生产工艺。张晓静2013.02纤维素酶的固体发酵法是以麸皮、谷糠、玉米秸秆等农业废弃物为主要原料，发酵条件接近于自然状态下真菌的生长条件，发酵后的酶可直接进行干燥、粉碎得到固体产品。优势：所产纤维素酶系更齐全，有利于降解天然纤维素，固态发酵投资少，工艺简单，生产成本低；劣势：所产纤维素酶难于提取、精制，制得的酶制剂外观粗糙且质量不稳定，生产效率较低，易污染杂菌，不适于大规模生产。张晓静2013.02纤维素酶现代工业化生产的主要方式是液体深层发酵法。优势：原料利用率高、生产条件易控制、产品质量稳定、劳动强度小、可大规模、自动化生产。劣势：发酵动力消耗大、对设备要求高。张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作①种子培养将经活化的PDA斜面上的里氏木霉菌种进一步扩大培养。种子培养基一般由麸皮、谷糠及无机盐类组成，其配方如下：麸皮80g、谷糠20g、(NH4)2SO42％、NaNO30.15％、MgSO4·7H2O0.05％、KH2PO40.05％(无机盐加量均指干料重的质量百分数)，自然pH，加水2~3倍干料重，以拌好后可捏成团但又挤不出水滴为宜。里氏木霉张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作①种子培养将适量培养基装入大三角瓶，灭菌后，取里氏木霉斜面孢子或事先制成的孢子悬液接入三角瓶,摇匀,置于28~30℃培养3~4d，至培养料长满孢子为止。视生产规模而定，三角瓶中的种子培养物可再扩大培养一级，至曲盘种子，曲盘所用培养基及培养方法同三角瓶，只是用三角瓶培养物接种。张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作②厚层通风发酵发酵培养基常采用以下配方：粉碎过20目筛子的稻草粉85~95g、麸皮15～5g、(NH4)2SO4为干料重2.5％、水250～300mL。培养基于蒸球中灭菌1h，将灭菌物料摊布在无菌通道上，待冷却至35～40℃之间备用。张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作②厚层通风发酵灭菌物料冷却至35～40℃之间后，将三角瓶或曲盘中的种子培养物拌入，接种量为0.2％~0.3％，混匀，装入底部有筛孔的曲箱中，厚度以20～30cm为宜(最高可达60cm)，物料应装得均匀疏松，防止干燥或吹风时龟裂引起通入的无菌空气短路。张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作②厚层通风发酵保持培养室温度30～35℃，室内相对湿度90％~100％，通过合理使用室内循环风和新鲜风的比例，维持室内相对湿度，当旺盛发酵过程中产热，品温升高，超过规定温度时，必须大量通风以散热，这样间歇通风直到发酵结束，一般发酵时间为64～72h。成品曲出箱后，打碎晾干。张晓静2013.02纤维素酶的固态发酵生产工艺操作③纤维素酶制剂的制备将打碎晾干后的成品曲进一步粉碎，①若生产饲用纤维素酶，则可再经气流干燥，即制得酶制剂粗品；②若制备纤维素酶纯品，则将粉碎的成品曲在28~30℃下用3倍水量浸泡2~3h，压滤机压滤或抽滤机抽滤，所得滤液用硫酸铵或乙醇沉淀，沉淀酶经压滤、干燥，再加稳定剂、经标准化混配后即成酶制品。沉淀时上清液，经离心去杂，再经超滤浓缩、喷雾干燥后回收酶粉。张晓静2013.02纤维素酶液态深层发酵生产里氏木霉茄子瓶孢子悬液硫酸铵或乙醇沉淀粉碎包装干燥种子罐超滤浓缩菌种斜面摇瓶扩培发酵罐过滤得上清液液体酶生产流程张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作①种子罐培养培养基成分可采用以下配方（质量分数,％）：稻草粉1、麸皮0.5、葡萄糖1、(NH4)2SO40.2、KH2PO40.1、CaCO30.1、Tween-800.02，pH5.5～6.0。121℃下灭菌30min，冷却后，接入三角瓶摇瓶种子或茄子瓶孢子悬液，28～30℃下培养24～36h，以备发酵罐接种用。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作②发酵罐培养发酵培养基为（质量分数,％）：稻草粉5、麸皮0.5、蛋白胨0.3、(NH4)2SO41、KH2P040.4、CaCl2·2H2O0.2，MgSO4·7H2O0.03，Tween-800.02，pH5.5～6.0。121℃下灭菌30min，冷却后，接入种子罐培养物，于28～30℃下培养96~120h。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作②发酵罐培养发酵过程中温度的控制--发酵前期，培养温度应稍高些,以利于菌体的生长，里氏木霉一般控制前期培养温度为30℃。进入产酶期后，应适当降低培养温度，一般为28℃,较低的温度有利于提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作②发酵罐培养发酵过程中pH的控制--随着发酵的进行，体系的pH逐渐下降，此时不予控制，当pH降至3.0以下时，可通过加入2mol/L的氨水来控制发酵液的pH维持在3.0±0.1，有利于产酶。发酵后期，随着培养基成分的逐渐耗尽，pH开始有所回升，此时不再加氨水，让pH自然上升，直至放罐。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作②发酵罐培养发酵过程中通气量的控制--里氏木霉是好氧菌，氧的不足将影响其生长和纤维素酶的产生，所以应保证发酵液中合适的溶氧量。发酵早期，菌体刚刚萌发，菌丝体数量较少，耗氧速率较低，应控制通气量为1:(0.2～0.3)；进入对数生长期后，菌体代谢旺盛，细胞大量分裂，菌丝体大量形成，此时耗氧速率加快，应控制通气量为1:1；产酶期，菌丝体数量最多，产生大量的酶蛋白，也消耗大量的氧气，应保持通气量为1:1。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作②发酵罐培养放罐的判断--以发酵液pH不再下降或回升，纤维素酶活力不再升高，并伴随发酵液黏稠度明显降低作为放罐的依据。一般发酵周期在96～120h，发酵结束时，发酵液的滤纸酶活力(FPA)一般可达5～10U/mL，CMC酶活力可达60～100U/mL。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02α-淀粉酶的固态发酵生产工艺操作③纤维素酶的提取将发酵液过滤，除去固形物和菌丝体，得清液。若生产液体酶,可将清液超滤浓缩5～7倍，制成液体酶。对于固体酶的生产，先将清液pH调至4.5(纤维素酶等电点附近)，然后进行硫酸铵或乙醇沉淀，离心或过滤得沉淀，将沉淀低温干燥后粉碎，即得纤维素酶粉。纤维素酶液态深层发酵生产张晓静2013.02三、纤维素酶的应用纤维素酶的应用极其广泛，几乎渗透到了一切以植物为原料的加工业，如纺织、饲料、酿造、果汁与蔬菜加工、粮食加工、造纸、中草药有效成分提取等各个方面。近年来，随着能源问题的日益严峻，利用纤维素酶降解秸秆原料生产