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RNA提取和反转录1、RNA提取1)匀浆：取50-100mg子宫和卵巢组织于液氮中研磨至粉状，加入1mL的TRIzol溶液，转移至1.5mLEP管中，颠倒混匀数下，冰上静置5min，使组织充分裂解。2)除去未裂解的组织：4℃，12000g离心5min，吸取上清至新的EP管中。3)分离阶段：加入200µL氯仿（1/5TRIzol量），剧烈振荡15-30s，冰上静置2-5min；4℃，12000g离心15min。4)RNA沉淀：将上层水相移入新的1.5mLEP管中，加入500μL预冷的异丙醇（1/2TRIzol量），充分混匀，-20℃静置20-30min；4℃，12000g离心10min。5)RNA洗涤：弃上清液保留沉淀，向沉淀中加入1mL现配的75%的乙醇（等TRIzol量），晃起沉淀，冰上静置5min，4℃，12000g离心10min。重复洗涤一次。6)RNA溶解：小心倒掉上清，留取沉淀置超净工作台风干30min，使mRNA呈半透明状（不能太干，否则很难溶解）；加入10-30μL的DEPC水吹打溶解RNA沉淀。7)RNA电泳检测：提取的总RNA电泳后得到28S、18S、5.8S（5S）三条清晰的rRNA条带，28S与18S的带宽比为2:1，说明RNA没有降解。8)RNA浓度和纯度检测：用微量分光光度计检测提取总RNA的浓度和纯度，OD260/OD280的值应在1.8~2.0之间，样品检验合格后，用DEPC水稀释至500ng/μL，置于-80℃冰箱保存备用或直接进行反转录。2、反转录按照Takara反转录试剂盒说明书(Cat#RR036A)操作，其反应体系(10μL)如下：5xPrimeScriptRTMasterMix2μLTotalRNA1μLRNaseFreedH2O7μL反应程序：37℃15min,85℃5sec,4℃保存。Real-timePCR1、引物设计根据NCBI上公布的大鼠的RGMbmRNA序列，用PrimerPremier5.0软件设计引物。引物详细信息见表2-1。GAPDH为内参。表3-1引物序列Table3-1Primersusedinthisstudy引物名称引物序列（5’-3’）退火温度/℃片段大小/bpRGMbF:CCATGTCCTACGAGGAAAGC58262R:GCAGCAGTAAAGTTGGCATCAGAPDHF:CAAGTTCAACGGCACAGTCAAG60123R:ACATACTCAGCACCAGCATCAC2、PCR反应1）反应体系：SYBRPremixExTaqII（2×）10μLPCRForwardPrimer（10μM）0.4μLPCRReversePrimer（10μM）0.4μLROXReferenceDye（50×）0.4μLDNA模板2.0μLddH2O6.8μLTotal20μL2）反应程序:Stage1：预变性，95℃30sec；Stage2：PCR反应，95℃5sec，60℃34sec，40个循环；Stage3：DissociationstageWesternblotting1、总蛋白的提取1)待RIPA裂解液融解、混匀后，取适量裂解液，使用前加入PMSF，使其最终浓度为1mM。2)样品中加入适量裂解缓冲液，匀浆机匀浆2min或超声波间断破碎1min；3)匀浆液或破碎液在液氮与冰上反复冻融数次后，冰上静置30min；4℃，12000g离心10min。4)小心地吸出上清蛋白溶液到新的小离心管中，注意不要吸入沉淀。5)测定样品总蛋白浓度，调整每个样品为相同浓度（约2-5mg/mL），分装后-70℃保存。2、蛋白浓度的测定1)取0.8mL蛋白标准配制液加入到20mg蛋白标准品（BSA）中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。2)取适量25mg/mL蛋白标准，用标准品稀释液稀释至终浓度为0.5mg/mL。3)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制BCA工作液，充分混匀。4)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。5)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL。6)各孔分别加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30min。7)测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。3、Westernblotting分析1)配制10％的聚丙烯酰胺凝胶。2)每份蛋白质样品（10-20μg）中加入等量6×SDS上样缓冲液，100℃变性5min后，进行SDS-PAGE电泳，80V电压约2h。3)电泳后，利用湿转电泳法将蛋白转移至PVDF膜上。4)室温下，将膜浸入5％BSA中封闭1h。5)TBST洗膜3次，每次10min。6)加入相应一抗，RGMb抗体的稀释倍数为1:500，β-actin抗体的稀释倍数为1:3000，于4℃摇床反应过夜。7)常温下用TBST洗涤膜3次，每次10min。加入HRP标记的IgG（1:4000）37℃摇床温育2h。8)常温下用TBST洗膜3次，每次10min。9)将杂交膜浸入ECL超敏发光液中放置2min，LAS4000荧光成像仪下拍照。用NIHImageJsoftware进行条带灰度分析。统计分析所有结果均用平均值±标准误（mean±standarderrorofthemean/SEM)表示。所有数据都用GraphPadPrism5(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)进行分析。差异显著性检验采用单因素方差分析(ANOVA)的Tukey后置检验法进行多重比较。标记字母相同表示差异不显著(P0.05)，字母不同则表示差异显著(P0.05)。