核磁共振基本原理

21:32:40第六章核磁共振波谱分析法第一节核磁共振基本原理nuclearmagneticresonancespectroscopy;NMRprinciplesofnuclearmagneticresonance21:32:40核磁共振波谱学的发展1946年，Purcell和Bloch观察到核磁共振现象。于1952年获得诺贝尔物理奖21:32:401945-1951年间，化学位移和自旋偶合的发现，NMR技术的化学应用。1953年世界上第一台商品化NMR谱仪.1964年世界上第一台超导磁场的NMR谱仪1971年世界上第一台脉冲傅立叶变换NMR谱仪21:32:40•1976年R.R.Ernst发表了二维核磁共振的理论和实验的文章。获得1991年诺贝尔化学奖21:32:401．原子核的自旋:atomicnuclearspinH0旋进轨道自旋轴自旋的质子一.基本原理如果放在外磁场中,原子核和电子一样,存在自旋.从而有自旋角动量(ρ)和磁矩μ21:32:40核的自旋角动量(ρ)是量子化的，不能任意取值，可用自旋量子数(I)来描述。2)1(hIII＝0、1/2、1……h:普朗克常数I=0，ρ=0，无自旋，不能产生自旋角动量，不会产生共振信号。只有当I＞O时，才能发生共振吸收,产生共振信号。I的取值可用下面关系判断：21:32:40质量数（a）原子序数（Z）自旋量子（I）例子奇数奇或偶25,23,21,,2111HI715919613,,NFC8171735511,25,,,23OIClBI偶数偶数01632816612,,SOC偶数奇数1，2，3……51071412,3,,,1BINHI21:32:402.自旋核在外加磁场中的取向(旋转方向)取向数=2I+1在没有外磁场时，自旋核的取向是任意的,并且自旋产生的磁场方向也是任意的.即：H核在外场有两个自旋方向相反的取向。H核：自旋取向数=2×1/2+1=2H01H'H'一致相反即：H核在外场有两个自旋方向相反的取向。H核：自旋取向数=2×1/2+1=2H01H'H'一致相反如果把H核放在外磁场中,由于磁场间的相互作用,氢核的磁场方向会发生变化:如:H的I=1/2,则:21:32:40每一种取向都对映一个能级状态，有一个ms。如：1H核：标记ms为－1/2和+1/2=H02E=h=H02hE=hH0H'H'ms=_1/2ms=1/2+νγπνγπν高能态低能态外场γ—磁旋比(物质的特征常数)21:32:40H0m=1/2m=-1/2m=1m=-1m=0m=2m=1m=0m=-1m=-2I=1/2I=1I=2zzz1PrH0HE2=+0△E=E2－E1=20E1=－0自旋核在磁场中的行为21:32:40能级分布与弛豫过程不同能级上分布的核数目可由Boltzmann定律计算：磁场强度2.3488T；25C；1H的共振频率与分配比：kThkTEkTEENNjijiexpexpexp两能级上核数目差：1.610-5；MHz00.10024.323488.21068.2280B共振频率999984.0KKJssJ2981038066.11000.10010626.6exp1123634jiNN弛豫(relaxtion)——高能态的核以非辐射的方式回到低能态。饱和(saturated)——低能态的核等于高能态的核。21:32:40讨论:共振条件：0=H0/(2)（1）对于同一种核，磁旋比为定值，H0变，射频频率变。（2）不同原子核，磁旋比不同，产生共振的条件不同，需要的磁场强度H0和射频频率不同。（3）固定H0，改变（扫频），不同原子核在不同频率处发生共振（图）。也可固定，改变H0（扫场）。扫场方式应用较多。氢核（1H）：1.409T共振频率60MHz2.305T共振频率100MHz磁场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4T（特拉斯）21:32:40氢核（1H）：14092G共振频率60MHz2.305T共振频率100MHz磁场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4T（特拉斯）60MHzHz1060106.621140921005.579.2634310Ih共振频率21:32:40讨论:在1950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构（化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移和裂分，如右图所示。由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化学环境的信息，进一步确定化合物结构。21:32:40四、核磁共振波谱仪nuclearmagneticresonancespectrometer1．永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2．射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。21:32:40核磁共振波谱仪21:32:4021:32:4021:32:403．射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4．样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转,磁场作用均匀。21:32:40NMR谱仪600MHz磁体探头机柜RF产生RF放大信号检测数据采集控制数据信息交流运行控制磁体控制前置放大器计算机数据储存;数据处理;总体控制.21:32:40NMR谱仪:探头RF接口RF线圈+调谐元件(电容器)HelmholtzSolenoid21:32:40RF-CoilinNMRProbes21:32:40傅立叶变换核磁共振波谱仪不是通过扫场或扫频产生共振；恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共振谱图。（类似于一台多道仪）21:32:4021:32:40超导核磁共振波谱仪：永久磁铁和电磁铁：磁场强度25kG超导磁体：铌钛或铌锡合金等超导材料制备的超导线圈；在低温4K，处于超导状态；磁场强度100kG开始时，大电流一次性励磁后，闭合线圈，产生稳定的磁场，长年保持不变；温度升高，“失超”；重新励磁。超导核磁共振波谱仪：200-400HMz；可高达600-700HMz；21:32:4021:32:4090年代末核磁共振波谱技术的新进展高场超导核磁谱仪的使用900MHz800MHz21:32:40样品的制备：试样浓度：5-10%；需要纯样品15-30mg；傅立叶变换核磁共振波谱仪需要纯样品1mg；标样浓度（四甲基硅烷TMS）：1%；溶剂：1H谱四氯化碳，二硫化碳；氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物；21:32:40NMR图21:32:401.化学位移:吸收峰所在的相对不同位置.在照射频率确定时，都是H核，所以吸收峰的位置应该是相同的,而实际不是这样.(1).化学位移的由来——屏蔽效应化学位移是由核外电子的屏蔽效应引起的。0HIhEh21:32:40H核在分子中是被价电子所包围的。因此，在外加磁场的同时，还有核外电子绕核旋转产生感应磁场H’。如果感应磁场与外加磁场方向相反，则H核的实际感受到的磁场强度为：)1('H0000HHHHH实式中：σ为屏蔽常数核外电子对H核产生的这种作用，称为屏蔽效应(如果产生磁场与外加磁场同向,称之为去屏蔽效应)。21:32:40显然，核外电子云密度越大，屏蔽效应越强，要发生共振吸收就势必增加外加磁场强度，共振信号将移向高场区；，共振信号将移向低场区。H0低场高场屏蔽效应，共振信号移向高场屏蔽效应，共振信号移向低场去21:32:40(2).化学位移的表示方法化学位移的差别约为百万分之十，精确测量十分困难，现采用相对数值。以四甲基硅（TMS）为标准物质，规定：它的化学位移为零，然后，根据其它吸收峰与零点的相对距离来确定它们的化学位移值。6010TMS试样化学位移试样的共振频率标准物质TMS的共振频率感生磁场H'非常小，只有外加磁场的百万分之几，为方便起见，故×106仪器频率21:32:40SiCH3CH3H3CCH3为什么选用TMS(四甲基硅烷)作为标准物质?(1)屏蔽效应强，共振信号在高场区(δ值规定为0)，绝大多数吸收峰均出现在它的左边。(2)结构对称，是一个单峰。(3)容易回收(b.p低)，与样品不反应、不缔合。21:32:40(3).影响化学位移(电子云密度)的因素:a.电负性:元素的电负性↑，通过诱导效应，使H核的核外电子云密度↓，屏蔽效应↓，共振信号→低场。例如：CCHbHaIαβ高场低场屏蔽效应：HbHaCHaHb高场低场屏蔽效应：HaHbO21:32:40b磁各向异性效应：A.双键碳上的质子双键碳上的质子位于π键环流电子产生的感生磁场与外加磁场方向一致的区域（称为去屏蔽区），去屏蔽效应的结果，使双键碳上的质子的共振信号移向稍低的磁场区δ=9.4～10δ=4.5～5.721:32:40c.共轭效应:电子云密度增加→磁屏蔽增加C=CHHHHC=CHHOCH3HC=CHHC=OHCH35.254.036.27d.Vanderwaals效应:在空间中两个氢核靠的很近时,核外电子会互相排斥,这时氢核电子密度下降,δ值变大.21:32:40第六节核磁共振碳谱(13C)简介有机化合物中C元素的重要性；核磁共振碳谱与氢谱的差别信号强度低：13C丰度为1.1％；磁旋比比1H小四倍；为1H谱图的1/6000。化学位移范围宽δ0～250(350)，有利于结构分析。耦合常数大13C与直接相连的1H的耦合常数在125～250Hz；一般通过质子噪声去耦，得到单峰。21:32:40弛豫时间长比1H慢；可得到较多信息；不能用于定量共振方法多、信息多质子噪声去耦、偏共振去耦、门控去耦。谱图简单一般为一级谱图。21:32:4021:32:4021:32:40第七节二维核磁共振谱二维谱是两个独立频率变量的信号函数S(ω1,ω2);目前，主要是先得到以独立时间为变量的信号函数S(t1,t2)，再经过傅立叶转换成为两个独立频率变量的信号函数。21:32:40二维谱图的表示方法21:32:40二维谱图举例121:32:40谱图举例221:32:40生物大分子空间结构的测定方法X射线晶体学多维核磁共振波谱学21:32:4021:32:40核磁共振的特点•蛋白质处于溶液状态•适合研究蛋白质-蛋白质，蛋白质-核酸，蛋白质-配基相互作用•可研究蛋白质分子内部运动•可研究膜蛋白核磁共振基本原理11讲吴季辉21:32:40NMRstructureoftherecombinantmurineprionprotein核磁共振基本原理11讲吴季辉21:32:40核磁技术和应用范围21:32:40蛋白质三维空间结构测定样品制备记录核磁共振谱谱峰归属确定二级结构单元约束条件的建立从NMR数据到分子模型核磁共振基本原理11讲吴季辉21:32:40药物设计和筛选21:32:4021:32:40hr-MASofbiologicaltissue相同强度LipidCH2-COLipidCH2-C=CLipidCH2-CH2-COLipidCH2LipidCH30.81.21.62.02.42.83.2(ppm)CitrateLactateAlanine放大＊１０人前列腺组织（prostatetissu）良性vs.恶性癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid）！！！21:32:40用NMR连续监测蛋白质复性过程Stopped-flow19FNMRspectraoftherefoldingof6-19F-tryptophanlabeledEscherichiacolidihydrofolatereductasefollowingdilutionfrom5.5to2.75Mureaat5Cintheprese