微遗-同源重组的应用

同源重组的应用09生工夏章传同源重组概述同源重组（homologousrecombination）◆即一般重组，是染色体之间进行遗传信息的方式之一，几乎所有生物都发生同源重组。◆如真核生物减数分裂中染色体的交换，细菌结合、转化、普遍性转导的遗传重组都属于同源重组。◆同源重组要求两个DNA分子的序列同源，同源区越长越有利于重组；同源区太短，则难于发生重组。因为它依赖于大范围DNA同源顺序的联会，负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列特异性，只要两条DNA序列相同或相近，重组便可以在联会部分的任何位置发生。当然，也存在重组热点，即某些序列发生重组的概率高于其它序列。◆同源重组也是对损伤DNA修复的一种重要途径，即重组修复。同源重组的应用◆同源重组的应用价值主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲进(knock-in)•①研究基因功能•②转基因动物的制备•③用于药物筛选的动物模型•④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物基因敲进和敲进◆基因敲除（knockoutofgene）:是基因打靶技术的一种，指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同或相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。◆基因敲进（knockinofgene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。◆基因敲除和敲进的原理都是同源重组，即同源双交换，用克隆的外源基因取代基因组中野生型等位基因。◆两者不同点在于，基因敲除导入的外源基因是失活的、无功能的基因，基因敲进导入的是有活性和功能的基因。因而两者的具体用途有所不同。◆基因敲除和敲进都可用于基因功能的研究，基因敲进则也可用于突变基因的修复。◆基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。小鼠基因敲除实验◆基因敲出实际操作简要步骤：1、克隆目的基因及其两侧的DNA序列。2、通过插入抗性基因或者DNA缺失，对克隆的目的基因进行体外遗传改造，使克隆的目的基因失活。3、将经体外改造失活的目的基因引入受体细胞，使之与野生型基因进行同源重组。◆这两种基因取代，都是是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。目前用于基因敲除的技术有Cre/LoxP系统、FLPI系统等。◆此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。①研究基因功能◆细菌和一些低等真核生物在进行基因取代时，克隆的基因能精确地插入到染色体的同源部位，所以他们是研究基因取代的理想材料。◆基因取代法除成功用于细菌和酵母菌的基因分析外，还成功地应用到老鼠和鸡的基因功能分析中。②转基因动物的制备◆转基因动物的应用领域1、生物反应器：药用或食品蛋白的大量生产，即转基因动物制药；2、疾病的动物模型：用于研究、药物筛选、药物治疗、毒物测试；3、通过增加或删除基因来研究基因的功能、调控和发育，如癌基因、免疫系统等；4、异种器官的移植；5、家畜品种的改良。◆转基因动物的应用领域③用于药物筛选的动物模型◆诱发性或实验性动物模型（ExperimentalAnimalModels）用同源重组的方法，将致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物患相应的传染病，又如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。诱发性疾病动物模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要等特点，因而为近代医学研究所常用，特别是药物筛选研究工作所首选。但诱发模型和自然产生的疾病模型在某些方面毕竟存在一定差异。因此在设计诱发性动物模型要尽量克服其不足，发挥其特点。③用于药物筛选的动物模型◆用于药物筛选的动物模型例如：帕金森病动物模型，用于药物筛选。建立抗丙型肝炎病毒药物筛选的动物模型。精神分裂症动物模型及其药物筛选。高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选。◆要求：（一）相似性（二）重复性（三）可靠性（四）适用性和可控性（五）易行性和经济性。③用于药物筛选的动物模型◆动物模型的意义和优越性：（一）避免了在人身上进行实验所带来的风险。（二）临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来。（三）可以克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点。（四）可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性。（五）可以简化实验操作和样品收集。（六）有助于更全面地认识疾病的本质。④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物。◆转基因动物生产药物不仅开辟了制药业的新纪元，而且它也是转基因动物研究最活跃的领域。◆基因工程药物3个阶段:1、细菌基因工程，即把目的基因通过适当的改建导入大肠杆菌中，再通过细菌等原核微生物表达的目的蛋白作为药物;2、是细胞基因工程药物，这是把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物的细胞中，生产有生物活性的产品;3、其三是利用转基因动物生产低成本、高活性的药物。一、转基因动物◆转基因动物是把外源基因导入动物的生殖细胞中，并整合该细胞后发育成为个体整合的外源基因，整合的外源基因又能影响其后代遗传的动物。药用蛋白基因→表达细胞株→细胞核转基因动物生产药用蛋白的基本过程受体动物供体动物→受精卵→无核受精卵→组装的核细胞→多细胞胚胎→假孕动物→动物幼崽→雌性转基因动物→乳汁→药用蛋白◆转基因动物生产药物的优点：1、品种多、产量高、质量好。2、设备简单、不耗能、无环镜污染。3、生产周期短。4、生产成本低。◆2006年报道：我国目前已有乳铁蛋白、白蛋白、凝血因子等进入临床试验阶段，首个转基因动物生产的药物有望在5年内上市。“究竟是哪种转基因药物率先上市，还得由临床疗效说了算。”◆转基因动物就是指通过实验方法，人工地把外源基因导入动物的受精卵，使外源基因与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代。在此基础上，人们只要将事先提取到的药用蛋白注射到牛、羊等身上，当它们的下一代出生，人们便可以从其体内提取更多的药用蛋白。简单地说，就像在动物的体内批量生产药物一样。◆此前，我国科学家曾在上海成功研制出5头有目的基因整合的转基因羊，其中一头羊产下小羊进入泌乳期后，其乳汁中有活性的人凝血因子IX显示，这种凝血因子恰是治疗血友病乙的珍贵药物。上海医学遗传研究所成功培育出含有人血清白蛋白的转基因试管牛。目前，科学家们正在进一步研究如何提高成功率。Theend,thanks!