PCR_引物设计及相关软件数据裤的使用

分子生物学实验课1、欢迎大家参加分生实验的学习；2、学习分生实验的重要性；3、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣；4、每组做一份实验5、上课时间：上午8:00,下午13:00.6、每天实验结束应主动整理实验台，值日安排。实验仪器的使用及注意事项加样器离心机一、加样器1、用途2、如何使用？根据取样量，选择合适的加样器。顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.5~20l100/200ul:20~100/200l1000ul:200ul~1000l5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?(1)首先观察目前读数,假设为050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l(2)顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大(3)加样器读数处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，超出量程，将会损害加样器的精度。如何调节加样器。1）选择加样器观察读数；调节读数；2）安装吸头（紧密）；3）吸取液体按加样器第一挡；将吸头插入液面下适当深度；松开拇指（缓慢）,吸取液体4）打出液体抬起加样器；估计体积是否正确；移入容器；按到加样器第二档；打出液体（匀速）加样器使用步骤(示教及学生练习)：加样器使用注意事项：1）吸头的安装（紧密）不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下2）吸取液体枪头不能插入过深或过浅，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。吸取完液体后，估计体积的准确性（加样器可能会不准）吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！3）打出液体观察吸头内液体是否完全打出1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。1代表转速盘上方的数据2代表下方的数据。3、样品配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).二、离心机4、设定时间(旋转时间转扭，然后自己记时间）。5、统一离心，逐渐升到要求转速。六个小组统一用一个离心机一起离心实验课的整体安排基因克隆3天.RNA提取逆转录及PCR重组质粒5天.重组质粒提取及酶切TA连接,T载体转化，平板筛选2天，基因组DNA提取及酶切后电泳离1天.序列查找及引物的设计4天PCR引物设计及相关软件数据库的使用本次实验课课件不允许拷贝介绍如何查找基因的序列介绍NCBI的数据库，及检索页面介绍如何设计PCR引物，及设计引物的注意事项•扩增目的基因的全长•扩增目的基因的任意一部分讲解的内容（上午）介绍常规的生物学软件的使用Primer5.0;Oligo6.0;Blast;PCRDESIGN；讲解的内容（上午）(一）如何查找基因的序列观看录像GenBank数据库GenBank---序列数据库GenBank---是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集网址：打开网络演示1.根据文献如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在Genbank中的ID号直接打开，在search后下拉框只中选择Nucleotide，把GnebankID号（AJ318831.1)输入GO前面的文本框中，点Go就可以找到了。例如：在2012年发表Biotechlogyletters文章(TheFMDVserotypebovineOFMDVusedtochallengesucklingmicewasstrainO/CHA/2/99(GenBankNO.AJ318831.1).，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把GenbankID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了注意：同学们应该学会看Genbank数据库中基因的ID号打开在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO...2.从Gene数据库中直接查找序列检索42项，哪一条是呢？（这也许是大多数人对Genbank的第一印象，东西太多，不知道是哪一个。）利用limits—高级检索Limits的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。提醒：注意一下右侧的基因相关信息，很有用的。可以看到Genomicregions,transcripts,andproducts，这里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：若你只想获得序列（例如设计PCR引物，可以选择FASTA格式。FASTA格式的序列文件，没有其他数字和格式的干扰。在获得FASTA格式的序列后，需要关注一下Genebank中CDS的信息，来确认该基因的编码序列。红色框中的才是IFN-gamma的编码序列IFN-cDNA的编码序列atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa3.从Nucletide数据库中直接查找序列打开在search后面的下拉框中选择Nucletide，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO...与gene数据库进入，查找的序列是一样的。2.从Gene数据库种查找基因序列的优势：可以查看基因在基因组中的位置可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种mRNA根据具体的课题需要选择mRNA剪接体，并选择其对应的编码序列Gene数据库与Nucleotide数据库查找基因序列的区别1.从Nucleotide数据库种查找基因序列的优势：直接查看基因的mRNA序列，查找方式比较简单，快速TNF-alpha有七个mRNA剪接体。(二）如何设计PCR引物观看录像什么是引物？引物设计的原则是什么？介绍常用的引物设计的软件。引物同源性分析介绍内容引物是人工合成的两段寡核苷酸序列。什么是引物？•PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。•PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。PCR反应需要两种引物，分别为5’引物和3’引物，或称为正向引物和反向引物。引物设计的原则3’5’5’3’5’5’targetsequence一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补。另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）。靠近正链5’端称为5’引物，靠近正链3’端称为3’引物正链负链首先回顾PCR原理：两条引物与模板结合的位置。5’引物3’引物atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaa3’5’3’5’atgaaatatacaagt上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合(1)5’引物照抄，3’引物互补倒读：Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）(4)引物方向：5→3(2)长度：特异性序列一般15-18bp.常18-27bp，应≤38bp。(3)碱基分布：嘌呤，嘧啶随机分布；避免出现堆积现象。GC比值为45-55%。3’端和5’端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。(5)引物的3端：严格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8个碱基要与模板严格互补。否则影响DNA聚合酶的延伸引物3′端要避开密码子的第3位引物5端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。标记生物素、荧光、地高辛等；(6)引物的5端：引物的5’-端设计限制性酶切位点后PCR示意图第一次循环第二次循环第三次循环(7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)不能有连续5个碱基的互补。引物末端一般不达到3bp。5´-GTTGACTTGATA3´-GAACTCTT(8)引物间不应存在互补序列.尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´(9)比较引物与基因组的同源性引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。利用Blast来分析引物与基因组的同源性稍后在讲已知IFN-cDNA序列,你该如何设计引物？atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa举一个实例：1.设计PCR引物---扩增目的基因的全长2.设计PCR引物---扩增目的基因的部分扩增目的基因的全长1.一般情况下，5’引物需位于编码基因的起始密码子的位置，3’引物位于编码基因终止子的位置。2.引物的5’端需加入多克隆酶切位点，方便后续的基因克隆操作。3.注意：保证基因的阅读框架的不能改变。5’ATGAAATATACAAGTTATATCT…………………….TCGAAGAGCATCCCAGTAA3’3’TACTTTATATGTTCAATATAGA………………………..AGCTTCTCGTAGGGTCATT5’第一步：扩增IFN-基本序列变性,引物复性atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的