PCR技术以及常见问题解析

PCR技术应用及常见问题解析南京凯基生物科技发展有限公司郭强分子平台负责人目录基因表达研究的背景传统PCR技术（链式聚合酶反应）PCR反应体系以及反应程序PCR常见问题分析实时定量PCR（Real-timePCR）实时定量PCR的原理实时定量PCR采用的方法实时定量PCR常见问题解析——凯基生物技术发展有限公司基因表达的研究背景DNARNAProtein复制复制转录逆转录调控调控翻译RNAribosomalRNA，rRNAtranferRNA，tRNAmessengerRNA，mRNAsmallnuclearRNA，snRNA——凯基生物技术发展有限公司顺式作用元件结构基因-GCGC---CAAT---TATA基因表达研究策略管家基因：house-keepinggene，是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因等。奢侈基因：Luxurygene，在特别细胞类型中大量(通常)表达并编码特殊功能产物的基因，具有组织特异性。——凯基生物技术发展有限公司3’基因表达研究策略SPreBCA成熟mRNASPreBCA多肽链内含子内含子sPreBCCA5’hnRNASPreBCA体外反转录cDNA——凯基生物技术发展有限公司基因表达研究策略cDNA：complementaryDNA，与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成。EST/mRNAGenomicPCR的指数扩增（2n）引物5’5’3’3’延伸变性、退火延伸变性、退火——凯基生物技术发展有限公司PCR技术（聚合酶链式反应）PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸——凯基生物技术发展有限公司PCR反应体系/程序曲线TimeTemp.94℃94℃55-58℃72℃72℃28-35cyclePCRbuffer------1dNTP-------------2PrimerI&II------3Template---------4MgCl2------------5DNA聚合酶----6——凯基生物技术发展有限公司1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件——凯基生物技术发展有限公司（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。——凯基生物技术发展有限公司（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。——凯基生物技术发展有限公司（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。——凯基生物技术发展有限公司2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链94℃，20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。——凯基生物技术发展有限公司（3）延伸70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加——凯基生物技术发展有限公司PCR常见问题分析：少量或者没有PCR产物RNA降解分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解RNA中含逆转录酶抑制剂70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂起始RNA量太低增加RNA的量多糖同RNA共沉淀用氯化锂沉淀RNA以除去多糖合成cDNA第一链合成的引物退火失败确定退火温度适合所用的引物RNA模板存在较多二级结构将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度反转录成功，PCR失败PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物MarkerSample1Sample2control有非特异条带引物和模板的非特异性退火基因特异性引物设计较差RNA中有基因组DNA的污染形成引物二聚体镁离子浓度太高提高反应的温度和特异性提高引物的特异性使用扩增级DNaseⅠ处理RNA设计在3'端没有互补序列的引物优化镁离子浓度M12——凯基生物技术发展有限公司引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。——凯基生物技术发展有限公司产生弥散（SMEAR）条带第一链产物的含量过高PCR反应中引物过多循环数过多退火温度过低寡核苷酸片段产生的非特异性扩增常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少PCR的循环次数提高退火温度提取高质量RNA，防止被DNA污染M123——凯基生物技术发展有限公司RT-PCR反应实例对组织或细胞的总RNA进行抽提把RNA反转录为cDNA然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码照分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化RT-PCR反应实例RT-PCR引物的选择：1.随机引物2.OligodT3.基因特异性引物RT-PCR实例：一、实验目的学习RNA提取的方法；学习PCR分析的原理与技术；分析用药处理后人肾小管上皮细胞CTGF基因表达情况——凯基生物技术发展有限公司二、实验材料、仪器和试剂1.材料：人肾小管上皮细胞等样本组织2.仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备、DEPC水等3.试剂：Trizol试剂（凯基试剂盒）RT-PCR试剂盒（凯基试剂盒）——凯基生物技术发展有限公司1.RNA的提取参照RNA提取试剂盒说明书三、操作步骤2.RNA质量的测定0123处理1处理2处理3处理4处理5A260/280A280A260280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景、盐浓度和蛋白等有机物的值。OD260/OD280（Ratio，R）1.8蛋白质或有机物的污染2.2RNA发生降解——凯基生物技术发展有限公司3.RTReactionRNA2-4ugxulOligodT10uM1.5ulDEPCwaterto10ul70℃水浴10分钟，冰浴5分钟，然后依次加入以下成分：RNAinhibitor40U/ul0.5ul10xAMVbuffer2.5uldNTP10mM1.0ulDTT200mM0.5ulAMVenzyme1.0ulDEPCwaterto25ul42℃水浴1小时，70℃保温10分钟终止反应。——凯基生物技术发展有限公司4.PCRReaction10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μLDNA1.0μLTaq0.2μL(5U)水补充至25.0μL——凯基生物技术发展有限公司表达模式以及结果分析В-actinCTGF比值C/B1处理1290.157234.1770.8072处理2297.954563.9861.8933处理3285.415489.2921.7144处理4306.537437.0271.4265处理5318.191318.8981.002——凯基生物技术发展有限公司实时荧光定量PCR实时定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。——凯基生物技术发展有限公司RealTimePCRandConventionalPCRVS1.实时在线监控：对样品扩增的整个过程进行监控，能够实时观察产物的增加，直观的看到反应的对数期2.降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高PCR反应的特异性3.增加定量的特异性：全程监控，准确的算法进行定量；结果分析快捷方便，无需跑胶——凯基生物技术发展有限公司荧光定量PCR和常规PCR技术的区别常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。——凯基生物技术发展有限公司RealtimePCRRegularPCRTemplateDNA(cDNA)DNA(cDNA)EnzymeTaqDNAPolymeraseTaqDNAPolymerasePrimersForward&ReversePrimersForward&ReversePrimersProbe*50-200nMtargetDNAseq.withfluorescenceDyeSYBRGreenordifferentkindsdye(FAM,TET..)NodyeProtocol1.Denature95oC1min.1.Denature95oC1min.2.Annealing60oC1min.2.Annealing60oC1min.3.Extension72oC1-3min.ordon'tneed.3.Extension72oC1-3min.4.Cycle40.4.Cycle20-30.AmplicondsDNA65-150bpdsDNAvaries--differentsizes.DataFirstAmplificationcycle--StartingQuantities.GelbandsMeltCurvesGelbandsRealtimePCR&RegularPCRComparasion荧光扩增曲线分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光信号指数扩增阶段平台期——凯基生物技术发展有限公司Cycle为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。——凯基生物技术发展有限公司荧光定量分绝对定量和相对定量每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。——凯基生物技术发展有限公司CopyNumbervs.Ct-StandardCurvey=-3.3192x+39.772R2=0.9967051015202530354001234567891011Logofcopynumber(10n)Ct绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。主要针对样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时，应用更广泛。需要内标基因做归一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。如GAPDH，β-actin,β2-mi