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-1-植物源性重组人血清转铁蛋白的多功能性概述人血清转铁蛋白（htf）是人血清中主要的结合铁蛋白质，在铁转运中有重要作用。另外，htf还有许多其他的作用，包括抗菌功能和对哺乳动物细胞增殖、分化中的生长因子效用。其多功能性使其在不同疗法和商业应用中有巨大价值。然而，htf的这些成功应用很大程度上取决于大量的高质量的htf的应用。本研究中，我们将植物作为获得重组htf的一种新平台。我们的研究表明转基因植物是一种获得rhtf的有效系统，最大积累量达到了全部可溶蛋白的0.25%（或高达33.5ug/g的叶子鲜重）。此外，植物源性rhtf保持了许多与天然htf相同的生物活性。尤其是rhtf在体外可逆性的结合铁作用，表明了其抑菌活性、在无血清培养基中的支持细胞增值的作用，和在体外内化进入哺乳动物细胞的性质。本研究的成功使得未来多领域应用植物源性rhtf成为可能。植物源性rhtf突出的应用就是作为特定细胞的一种新的载体或者作为蛋白质/肽段药物的口服递送以治疗人类疾病例如糖尿病。为证明此假说，我们在植物中又额外地表达了一种包含胰高血糖素样肽段-1（GLP-1）或其衍生物的htf融合蛋白。在此，我们展示植物源性htf-GLP-1融合蛋白保持了体外培养基中内化进入哺乳动物细胞的能力。简介转铁蛋白Tf包含了所有脊椎动物体内发现的一系列同源性的铁结合蛋白糖蛋白（AisenandHarris,1989），主要功能是铁的螯合和转运。Tf是一种单分子蛋白，分子量范围为76-81kDa，取决于糖基化程度。每种TF蛋白包含两种相似的裂片，分别叫做N-末端和C-末端，每一裂片包含单一的铁结合位点（AisenandHarris,1989;Bakeretal.,2002）。hTf是转铁蛋白Tf家族的主要成员。hTf蛋白由679个氨基酸组成，主要在肝脏合成并分泌入血（MacGillivrayetal.,1983）。hTf的主要功能是络合血中的游离铁并将之转运到全身各处（MacGillivrayetal.,1983）。放射示踪研究显示至少80%的络合至tHf的铁转运至骨髓并组成新生的红细胞（FinchandHuebers,1982）。除其众所周知的铁转运功能外，hTf还有许多额外的功能，许多与其携铁能力无关。例如，研究显示HTF可促进体外无血清培养基条件下鼠粒性白细胞和巨噬细胞前体细胞的克隆生长（IizukaandMurphy,1986）。另外，HTF的存在对于大多数哺乳动物细胞的培养有重要作用，例如体外受精培养（Holstetal.,1990）和肝细胞群体的维护和扩展（Suzukietal.,2006）。当增殖细胞高表达HTF受体以允许HTF包裹并可能引发和维持细胞DNA合成时，HTF常常作为一种生长因子（Gommeetal.,2005）。HTF的其他作用包括抵抗细菌、酵母菌、病毒和真菌的抗菌活性（(Artisetal.,1983;Salamahandal-Obaidi,1995），降低细胞粘附的能力（Ardehalietal.,2002）。HTF的多功能性可以作为潜在的治疗和非治疗应用。例如，HTf已被用来治疗人类转铁蛋白缺乏症（一种以贫血、铁超载、生长迟缓和感染发生率增加为特点的状况）（Hayashietal.,1993），局部贫血-再灌注损伤（促进氧化应激导致炎症、最终因凋亡和坏死而导致细胞死亡的一种情况）（Hayashietal.,1993）和心血管疾病（Hayashietal.,1993）。HTF的治疗送递也降低了放射疗法的副作用（Koterovetal.,2003），有助于为骨髓移植患者提供抗微生物活性的作用（vonBonsdorffetal.,2003）。此外，HTF已用来作为一种新的载-2-体系统，在体内运载药物入癌细胞（Laskeetal.,1997）。近来，HTF被证实作为一种高效的载体，以送服口服蛋白质和氨基酸药物入内脏以实现全身治疗效果（Wideraetal.,2004;Baietal.,2005）。HTF蛋白也有许多巨大的潜在非治疗应用。例如，许多无血清培养基以HTF作为血清代用品，支持哺乳动物细胞生长（BarnesandSato,1980a,b）。为了使HTF的这些商业和治疗应用具备可行性和得到实现，大量HTF的可靠、廉价的供应是很重要的，取决于一种高效、性价比合算的重组生产系统。迄今为止，已有数种表达系统报道获得重组HTF。描述的RHTF的细菌表达，仅允许生产蛋白质的氨基末端和羧基末端领域（半分子）（Ikedaetal.,1992;SteinleinandIkeda,1993;deSmitetal.,1995），随着19HTF分子内二硫键的出现，使得利用微生物主机获得这种蛋白成为了一项挑战。使用细菌获得重组ＨＴＦ的进一步限制，是其从重组蛋白到获得功能性产品过程中无法去除信号肽（MacGillivrayetal.,1998）。作为一个可选择的细菌生产系统，已证实rhTf在幼仓鼠肾（ＢＨＫ）细胞的表达（Funketal.,1990;Masonetal.,1991,1993,2001）。虽然成功了，但幼仓鼠肾细胞系统受限于低产量的rhTf（nomorethan40mg⁄Lofcellculture）。为了降低生产难度，已研究了数个表达系统，包括酵母菌（仅在ＨＴＦ的Ｎ－末端领域和两个ＨＴｆ突变类型表达）（Steinleinetal.,1995;Sargentetal.,2006）、使用杆状病毒表达系统的昆虫细胞（20毫克⁄L的细胞培养）（Alietal.,1996）和果蝇Ｓ２细胞（不超过0.35毫克⁄L的细胞培养）（Limetal.,2004）。因为这些系统都是依靠昂贵的细胞培养和发酵方法，他们不适合低成本的规模化生产。此外，哺乳动物的细胞培养很容易受到细菌和病毒病原的污染，导致产品安全的担忧。植物生物反应器已被证实作为一种有效的、有吸引力的重组哺乳动物蛋白的生产平台（Schillbergetal.,2005;Daniell,2006;Boehm,2007）。作为生物反应器，植物允许无限的可扩展性，通过哺乳动物病原体消除产品污染，以及与微生物或动物相比，使用细胞培养系统降低了生产成本（Daniell,2006;Boehm,2007;Maetal.,2008）。因为他们的真核特性，植物可以进行复杂的转译后修改和加工，这是许多转基因哺乳动物具有治疗作用的蛋白质的生物学和⁄或免疫学功能所要求的。此外，可食用的转基因植物组织提供了允许植物源性治疗蛋白质和多肽直接口服递送的可能性，消除了昂贵的下游蛋白纯化和加工。在本研究中,我们已经证实了利用转基因植物作为生产rhTf新体系的可行性。因为天然hTf是一种分泌分子，rhTf是针对转基因植物内膜系统以提高积累的。在此，我们证明了转基因烟草植物是一个有效的生产rhTf表达系统，最大限度积累可达0.25%的全部可溶性蛋白质（ＴＳＰ）（或者高达33.5ｕｇ／ｇ鲜叶组织）。转基因蛋白质的生化和功能特性表明了植物源性ＲＨＴＦ是非糖基化的，正如酶和化学去糖基化分析证实的，保留的多项与天然hTf性能相同的性能。尤其是，植物源性rhTf在体外可逆性地络合铁，证实了抑菌活性，在无血清培养中支持细胞生长和增殖，并保留了在体外内化进入哺乳动物细胞的能力。这些结果表明，植物源性rhTf可能存在许多潜在应用价值。最重要的功能是，使用rhTf作为特定细胞或口服递送的蛋白质和多肽药物的新载体分子。为了验证这个假说，我们在转基因植物中额外引入了一个rhTf融合蛋白，包含抗胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其衍生物。已证明，当加入到体外细胞培养基，植物源性rhTf-GLP-1融合蛋白有内化进入哺乳动物细胞的能力。-3-该研究结果具有重要的影响，其中包括开发植物源性rhTf作为一种新的靶向给药系统的可能性，以及未来开发出基于新的植物源性rhTf治疗广谱疾病方法的可能性。结果转基因植物的植物表达载体的构建和产生二进制植物表达载体ｐＲＪＣ－ｈＴｆ的产生，强本构CaMV35S促进剂促进了hTf的表达天然信号肽如图1表明。来源于烟草蚀刻病毒（ＴＥＡ）ＲＮＡ的５＇端输出序列和３＇内质网（ＥＲ）保留信号主题ＫＤＥＬ整合入ｐＲＪＣ－ｈＴｆ以最大限度ｒｈＴｆ积累（(Maetal.,2005;Wangetal.,2008）。即时插入上游信号KDEL的6xHis标签整合到ｐＲＪＣ－ｈＴｆ上，以通过固定化金属亲和层析促进下游ｒｈＴｆ的纯化（ＩＭＡＣ）。低生物碱烟草变种８１Ｖ９（Menassaetal.,2001）是利用含有pRJC-hTF的根癌农杆菌转变的。所产生的20多个独立的转基因烟草株，与所有转基因植物，表现出了正常的生长和发育，与非转变烟草cv.81V9相比没有表型方差。hTf整合入核基因组，且其在转录水平的表达，分别经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）而得到证实（数据未显示）。转基因植物的rhTf蛋白质积累rhTf在转基因植物的积累，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及其后的使用市面可得的抗hTf抗体的免疫蛋白印迹得到印证。总蛋白萃取物时从植物获得的，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得rhTf阳性表达。如图２ａ，抗ｈＴｆ抗体检测到一个明显的分子质量76ｋＤａ的单一蛋白，与ｈＴｆ标准等同尺寸（Sigma-Aldrich）。不出所料，在相同的条件下的野生植物叶子提取物中没有检测到蛋白质带。烟叶提取物中rhTf的相对积累量的测定，采用间接的抗hTf抗体ELISA法与一个hTf标准比较。rhTf的积累水平，发现在独立主要转基因植物(T0plants)，范围从0.07%到0.25%ＴＳＰ（或6至33.5ｇ／ｇ鲜叶重）。此外，转基因烟草植物的rhTf有明显的空间分布的差异，最上面的叶子表现出最高水平转基因蛋白质积累（数据未显示）。植物源性ｒｈＴｆ是非糖基化的为了研究植物源性rhTf的醣化作用，重组蛋白进行了酶、化学去糖基化。对酶的去糖基化，总蛋白提取物以及通过His-purification得到的植物源性rhTf的部分纯化样品，用PNGaseF处理并通过使用抗hTf抗体的免疫印迹法分析。在PNGaseF处理之前，纯化rhTf的完整性，通过Coomassiebulestainong考马斯亮蓝染色在SDS-PAGE上确认。hTf蛋白包含两个可能的糖基化位点羧基末端区域（Asn413andAsn611）（Spiketal.,1975）。用PNGaseF对糖基化hTf标准（Sigma-Aldrich）的消化作为阳性对照。PNGaseF能够去除高甘露醇和复杂类型N-聚糖，除了含有a-(1,3)-linked的核心海藻糖，一般在植物糖蛋白中发现（Lerougeetal.,1998）。如图3示：与未经处理的对照样品相比，在经PNGaseF处理的总蛋白提取物或部分净化的rhTf样品中没有看到可察觉到的漂移带。相反，在相同条件下，商业糖化hTf标准和PNGaseF的消化，降低了其分子量至大约73kDa的单带，这正是期待的hTf的非糖基化成分。与酶去糖基化得到的结果一致，使用三氟甲磺酸His-purified的植物源性rhTF的化学去糖基化，这非特定地移除所有伴随蛋白质的碳水化合物，导致rhTf的移动性没有变化（图3b）。加在一起，这些结果表明植物源性rhTf是非糖基化的。非糖基化的植物源性rhTf分子量比去糖基化hTf标准的分子量稍大（图3a）。最可能的原因是增加了6xHis标签（900Da）和增加到植物源性rhTf的C末端的内质网ER保留的信号主题KDEL（600Da）。此外，以前的观察表明酶裂解了两个碳水化合物链的天然hTf的分子量，如SDS-PAGE证明的那样，小于计算出的hTf的理论分子量（RiebeandThorn,1991）。然而，植物源性rhTf分子量的提高不可能是因为植物源性rhTf的信号肽序列的不完全处理。我们先前已证实动物蛋白的天然信号肽在植物细胞内是正确加工处理的-4-（Maetal.,2005;Wangetal.,2008），这也进一步被其他人证实（