DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定1、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。2、学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E.coli的原理与方法。4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，并验证重组子是期望的重组子。2、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。目前已经鉴定出3种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II型酶和III型酶。Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性核酸内切酶对DNA底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响：1）DNA样品的纯度，可采取措施有纯化DNA、加大酶的用量、延长酶催化反应的保温时间，扩大反应体积；2）DNA的甲基化程度，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株；3）酶切消化反应的温度；4）DNA的分子结构；5）限制性核酸内切酶的缓冲液。限制核酸内切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重组技术中限制性核酸内切酶主要用在一下几方面：①构建重组质粒；②构建基因文库；③DNA分子的杂交；④制备DNA放射性探针；⑤绘制DNA分子的限制酶图谱⑥DNA序列分析；⑦基因定位及DNA同源性研究。2、限制性内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。（1）双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目的DNA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。（2）单酶切法：:如果目的DNA片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA分子的工作量大很多。单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。3、DNA连接酶DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA片段的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。T4DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。DNA连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸内切酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂交DNA分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3种体外连接DNA片段的方法：①用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；②用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA连接酶连接起来；③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA连接酶连接起来。这3种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。4、载体与外源DNA的连接反应外源DNA片段与载体分子的连接，即DNA分子体外重组，主要依赖于DNA连接酶来完成。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式主要有以下几种：（1）互补粘性末端片段之间的连接当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为2:1（插入片段摩尔数:载体摩尔数）。（2）平末端及非互补黏性末端片段之间的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。既然在一定反应条件下，用T4DNA连接酶可以将平末端的DNA片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的S1核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4DNA连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。影响DNA连接的因素有温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA判断的大小等。温度，理论上最佳温度是37℃，此时酶的活性最高，但37℃时粘性末端分子形成的氢键配对极不稳定，因此我们选择在12~16℃进行连接。时间，在最适温度下，一般粘性末端连接30min即可取得较好的效果，连接60min则更完全些，为了实验方便有时也在4℃下连接过夜。而对于平末端建议在4℃下连接，并且时间适当延长。更为普遍的条件是：16℃连接过夜酶单位（Takara）在20ml的连接反应体系中，6mg的λDNA-HindⅢ的分解产物在16℃下fanying30分钟时，有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。酶量，连接实验中DNA的浓度比酶量定义状态下低很多倍，所以酶是过量的。Takara的T4-DNA连接酶浓度是350U/ml。缓冲体系（buffer），Tris-HCl提供连接所需的合适的ph值，DTT提供还原力，ATP促进连接反应的有效进行。DNA浓度，连接反应中DNA的浓度一般为0.1~1pmol/ml。其中载体浓度过高会增加载体间分子的环化，而过低则获得重组分子的效率低，甚至导致载体分子的自身环化，外源DNA则依据连接类型的不同加入载体浓度的1~10倍。5、感受态细胞的制备与质粒转化体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是CaCl2诱导的大肠杆菌转化法。感受态是指宿主细胞最容易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，由受体菌的遗传性状决定，同时也受菌龄和环境因子的影响。感受态的细胞一般出现在对数生长期。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。CaCl2诱导的大肠杆菌转化的原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，同时钙离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，钙离子又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。影响感受态细胞制备及转化的因素有细胞的状态、DNA的质量和浓度、试剂的纯度等。（1）细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期；应为限制-修饰系统缺陷菌株；感受细胞和所转化的载体性质应匹配。（2）质粒DNA的质量和浓度：超螺旋构想的质粒DNA，较其线性构想的转化率高10~100倍；加入DNA的体积不应超过感受态细胞的5%，1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。（3）其他药品、试剂质量：氯化钙应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需无菌、冰浴操作。5、α互补利用β-半乳糖苷酶筛选系统，跟据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，而其对应的宿主菌染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入相应宿主菌后，通过