新型重组类人胶原蛋白医学及其应用

┃Human-likeCollagen类人胶原蛋白胶原蛋白传统提取方法的问题国内外重组胶原蛋白概况[1]He|ckeT．Gelatin，Thefoodtechnologist’sfriendorfoe．InternationalFoodIngredients．2000．1，6-8．病毒隐患•动物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人体传染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的传染危险[2]排异反应•异种或异体排斥反应,导致植入部位无菌性炎症以及细胞数量和形态改变细胞毒性•不溶于水，加工过程中所用的酸、碱、盐溶剂很难脱除完全,产生细胞毒性，并降低细胞粘附性制备方法：○酸水解法○碱水解法○酶解法原料来源：猪/牛/驴/鱼等动物的结缔组织123FDA、欧盟对动物源胶原蛋白医学应用的限制[2][3][4]2.Cooperman,L.andMichaeli,D.,1984,Theimmunogenicityofinjectablecollagen.I.A1-yearprospectivestudy.JAmAcadDermatol,10:638-646.3.Lee,C.H.,Singla,A.andLee,Y.,2001,Biomedicalapplicationsofcollagen.IntJPharm,221:1-22.4.Olsen,D.,Yang,C.L.,Bodo,M.,Chang,R.,Leigh,S.,Baez,J.,Carmichael,D.,Perälä,M.,Hämäläinen,E.R.,Jarvinen,M.andPolarek,J.,2003,Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvDrugDelivRev,55:1547-1567.寻找一种安全、有效并具有良好生物功效的胶原蛋白类材料在组织工程、医药美容等领域受到越来越广泛的关注2000年MyllyharjuJ等人使用甲基酵母表达生产准人纤维胶原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型[5]1998年NokelainenM等用两种杆状病毒转染昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原II型[6]2001年NokelainenM等使用四种人类基因报道了使用甲基酵母高水平表达I型前胶原[7]UittoJ等从人皮肤细胞体外培养中得到了Ⅰ，Ⅲ型前胶原[8]VaughnPR等在啤酒酵母中表达出了携带有羟基化片断的类人Ⅲ型胶原蛋白[9]由于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养成本高,周期长,重组胶原蛋白表达量极低(1%左右)，培养只能限于实验规模,不可能满足产业化、大批量的需求[5]MyllyharjuJ，NokelainenM，Vuorela人KividkkoKI．ExpressionofrecombinanthumantypeI-IIIcollagensintheyeastpichiapastoris．BiochemSocTrans．2000．28(4)，353-7．[6]NokelainenM，TuH，Vuorela^NotbohmH，KivirikkoKI,MyllyharjuJ．High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris．Yeast．2001J蚰30．18(9)．797-806．[7]NokelainenM，HelaakoskiT，MyllyharjuJ，NotbohmH，PihlajaniemiT'FietzekPP，KivirikkoKI．ExpressionandcharacterizationofrecombinanthumantypeIIcollagenswithlowandhighcontentsofhydroxylysineanditsglycosylatedforms．MatrixBi01．1998Jan．16(6)，329-38．[8]UittoJ，BoothBPolakKL．CollagenbiosynthesisbyhumanskinfibroblastsIIIsolationandfurthercharacterizationoftypeIandtypeIIIprocoUagenssynthesizedinculture．BiochimBiophysActa．1980Aug21．624(2)，545—61．[9]VaughnPR，GalanisM，RichardsKM，TebbTA，RamshawJA，WerkmeisterJA．Productionofrecombinanthydroxylatedhumantype1IIcollagenfragmentinSaccharomycescerevisiae．DNACellBi01．1998Jun．17(6)，511—8．在中国,西北大学的范代娣等[10,11]采用PCR(聚合酶链式反应)扩增，得到数段人胶原蛋白基因段，接着进行拼接重复,转化E.coli(大肠杆菌)，并通过高密度发酵培养生产人源性胶原白，所得重组胶原蛋白表达量高达29.4%[12][10]AdaehiT.,etal.GenerationofhybridtransgenicsilkwormsthatexpressBombyxmoriProlyl-hy-droxylasea-subunitsandhumancollagensinposteriorsilkglands:Productionofcocoonsthatcontainedcollagenswithhy-droxylatedpralineresidues[J].JournalofBiotechnology2006,126(2):205~219[11]骆艳娥,范代娣,花秀夫,张兮.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程研究.西北大学学报2005,35(2):180~183[12]胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展陈光徐珍珍吴铭明胶科学与技术第31卷第1期2011年3月Vol.31.No.1Mar.2011.类人胶原蛋白的来源和制备类人胶原蛋白的创新性类人胶原蛋白的实验研究质粒载体人胶原蛋白基因构建原始菌(不具胶原合成能力)重组菌(胶原蛋白生产菌)基因工程菌的构建反馈补料压力脉冲饥饿胁迫定向调控高密度发酵离心除杂除杂蛋白除内毒素类人胶原蛋白蛋白质分离纯化的来源和制备通过基因重组和生物工程技术得到的，一种水溶性高分子生物胶原蛋白在结构、特性方面与人类胶原蛋白极为相似，命名它为类人胶原蛋白ECM示意图无细胞毒性基因工程单细胞蛋白-从根本上杜绝隐患-保证医学应用安全低排异反应无病毒隐患来源于人类基因-结构最大程度相似-修饰过程去除端肽溶于水-没有酸碱溶剂残留-避免影响细胞代谢单螺旋线性结构pH值6.5-7.5-保持皮肤酸碱平衡-维持细胞粘附性变性温度高酸碱度中性变性温度72℃-动物胶原37℃-40℃-易于储运保存使用分子量90kD-利于皮肤渗透利用-均质结构稳定性强全身毒性实验细胞毒性实验皮肤刺激实验眼部刺激实验皮肤过敏实验亚慢性毒性实验遗传毒性实验皮下植入实验植入实验评价:小鼠、家兔皮下植入，90天无不良反应小白鼠背部去毛清洁后，涂抹荧光染料(tritc)标记过的明胶和类人胶原蛋白溶液；于4h，8h分别在涂抹试样区域取1cm×2cm大小的皮肤，进行冰冻切片，采用荧光显微镜观察；结果表明：类人胶原蛋白具有较强的透皮吸收行为，而明胶的透皮吸收较差。[14][14]TheTransdermalAbsorptionStudyofHuman-LikeCollagen.AdvancedMaterialsResearch,415-417:1781-1985明胶涂抹8h后明胶涂抹4h后类人涂抹8h后类人涂抹4h后皮下真皮表皮皮下真皮表皮[15]程宁,范代娣类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)，35(5):581-584,20050.1%类人胶原蛋白可促进成纤维细胞和上皮细胞的生长，其作用明显优于0.1%的维生素C和0.1%的明胶，其促进细胞生长的速度，是对照组的1.4-1.6倍。050100150促成纤维细胞生长比例（%）1培养时间（天）2促成纤维细胞生长示意图对照维生素C明胶类人胶原蛋白050100150促上皮细胞生长比例（%）1培养时间（天）2促上皮细胞生长示意图对照维生素C明胶类人胶原蛋白[15]程宁,范代娣类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)，35(5):581-584,2005结果显示：应用类人胶原蛋白溶液培养细胞，细胞数量有大幅度增加，细胞形态正常、透亮饱满。结果显示：14天时成纤维细胞大量贴附在类人胶原蛋白海绵表面，且生长良好。反映了类人胶原蛋白具有良好的细胞亲和性和相容性。类人胶原蛋白海绵表面2BS培养14天后扫描电镜观察[15]程宁,范代娣类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)，35(5):581-584,2005试验方法：将类人胶原蛋白海绵、动物胶原蛋白海绵和可吸收明胶海绵分别植入兔子肝脏，4周后开腹观察植入处的肝组织。[16]类人胶原蛋白生物相容性实验研究《西北大学学报（自然科学版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大学范代娣，米钰，惠俊峰等类人胶原蛋白细胞核形态正常明胶海绵细胞核皱缩动物胶原海绵细胞核皱缩变形结果表明：•明胶海绵和动物胶原蛋白海绵植入处造成细胞形态和数量改变，组织肿胀，大量炎性细胞浸润•类人胶原蛋白海绵对植入处肝细胞形态几乎不造成影响，细胞器的形态较好；组织相容性好，优于供试的其他产品类人胶原蛋白植入处组织形态正常少量炎性细胞浸润明胶海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀动物胶原海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀[16]类人胶原蛋白生物相容性实验研究《西北大学学报（自然科学版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大学范代娣，米钰，惠俊峰等皮肤美容止血材料骨修复材料人工血管皮下注射填充皮肤美容:眼膜、面膜、喷雾、原液等系列；用于衰老性肌肤紧致抗衰；日常的肌肤养护；皮炎、痤疮、敏感肌肤等问题肌肤的修护。生产环境为万级条件下的局部百级，等同于手术室的洁净要求亲和层析+凝胶过滤层析+超滤的纯化工艺，可满足体内植入的要求所采用的为注射用水，无菌、无内毒素可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血可吸收明胶海绵动物胶原蛋白海绵进口可吸收纱布类人胶原蛋白止血海绵可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血马茂，范代娣壳聚糖-类人胶原蛋白对兔肝创面的止血效果及组织相容性观察，第四军医大学学报，2007，28(12):1122-1124专利成果：一种可生物降解止血海绵材料及其制备方法。专利号：ZL200610041913.3一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法。申请号：200910218514.3骨修复材料:仿生矿化，制备骨修复材料，用于骨缺损的修复人工血管：模拟人体血管结构，仿生制备，用于血管修复注射填充水凝胶应用领域采用皮下注射或填充，可用于去皱、丰唇、面部矫形、凹陷填充等。产品特点1.生物相容性优异；2.降解时间可控；3.产品可促进注射部位细胞活性和胶原蛋白纤维的再生研发团队研发成果产业化之路范代娣：新世纪“百千万人才工程”国家人选获“中国青年女科学家”提名享受“国务院特殊津贴”博士生导师研发团队：博士研究生20余人硕士研究生50余人XiaoxuanMa,DaidiFan,Long-anShang,QiangCai,LeiChi,ChenhuiZhu,YuMi,Yan-eLuo.Oxygentransferratecontrolintheproductionofhuman-likecollagenbyrecombinantEscherichiacoil.BiotechnologyandBiochemistry.2010,55,4：169-174(SCI)WenjiaoXue,DaidiFan,Long