cDNA文库构建

cDNA文库的构建现代生物技术讲座主要内容基因文库的概念及意义cDNA基因文库的类型几种cDNA文库的介绍SMART技术构建全长cDNA文库一、基因文库的概念及意义文库（library）：指一种全体的集合。基因文库（genelibrary）:是某一生物类型全部基因的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。基因文库与基因库（genebank）区别基因文库与基因克隆基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。构建基因文库的意义☆使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来;☆是一种分离克隆目的基因的主要途径；☆基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。根据基因类型（重组DNA片段的供体）基因组文库和cDNA文库1、基因组文库★基因组文库(genelibrary)：用重组DNA技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库。它包含该生物所有基因。★根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和叶绿体基因文库•构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）基因组物理图谱的构建基因组序列分析基因在染色体上的定位克隆鉴定基因调控元件基因组中基因的结构和组织形式分析基因组DNA文库应用结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA2、cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA(简称cDNA)。cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。cDNA文库优点(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5)cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从cDNA文库中筛选到所需目的基因，并用于该目的基因的表达。一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementaryDNA，cDNA）。信息量远小于基因组文库注意(1)细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。3、cDNA文库和基因组文库的区别时效性cDNA文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因，序列组成不同cDNA文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。两种文库均有应用，如何选择根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。二、cDNA基因文库的类型依据起始mRNA是否经过标准化预处理：非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库文库功能：克隆文库和表达文库载体类型：质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通cDNA文库和全长cDNA文库依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligod(T)cDNA文库（一）非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库依据起始mRNA是否经过标准化预处理，可将文库分为非标准化cDNA文库(unnormalizedcDNAlibrary)和标准化cDNA文库(normalizedcDNAlibrary);前者反映了组织中所有基因的表达水平，适于基因表达谱分析，但文库中冗余较高，发现新基因效率低。后者往往经过杂交（均一化）、扣除杂交(subtractivehybridization)、抑制性扣除杂交(suppressionsubtractivehybridization)处理，不能反映建库材料的基因表达情况，不能用于表达谱构建，但是新基因发现效率提高了。在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA，或不同时空、不同环境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。（二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库（1）克隆文库由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。克隆基因主要利用核酸探针，可用蛋白质序列或同源序列。（2）表达文库由表达载体构建，载体除具有克隆载体的元件外，还具有控制基因表达的序列，如启动子、SD序列、ATG、终止子等，可在宿主细胞内表达出克隆片段的编码序列，它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。分离基因时，由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗原性和生物活性，所以除核酸探针外，还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因分离。（三）不同载体文库主要有质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体四大类，每类中由有许多不同的载体，不同的载体适于构建不同的基因文库。质粒文库噬菌体文库粘粒文库人工染色体文库构建文库的载体1.λ噬菌体载体基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。重组筛选：插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“填充片段”gam和red基因座丢失引起的。供体DNA的大小：插入载体：0-10kbp;置换载体：9-23kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。主要应用：插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。置换载体:基因组DNA克隆。2.粘粒(cosmid)载体基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒；导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞；载体筛选：类似于质粒重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选；供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。主要应用：基因组文库构建。真核基因组DNAλ取代型λ噬菌体载体COSCharon4A机械剪切EcoRIEcoRI酶切加人工接头酶切连接coscos体外包装转染E.coli3.质粒载体构建cDNA文库双链质粒DNA5’3’AAAAAAn加锚定引物(寡聚T)pBR3225’3’AAAAAn3’5’TTTTRT酶限制酶用NaOH降解mRNA用Klenow酶合成第二链SI酶降解发夹结构末端转移酶dGTP末端转移酶加寡聚CCCCCCCGGGGGG连接转化E.coli扩增以质粒为载体构建cDNA文库4.大容量克隆载体基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。载体系统克隆容量评价YAC(酵母人工染色体)酵母着丝粒,复制起始点和端粒200kb～2Mbp嵌合发生率高(在基因组中不相连的连续片段)；不稳定(自发缺失)；很难与酵母染色体分离；PAC(P1人工染色体)细菌噬菌体P1100～300kbBAC(细菌人工染色体)F质粒300kb稳定，但在细菌外难以维持MACs(哺乳类人工染色体)基于Epstein-Barr病毒的游离载体300kb人类人工游离染色体(humanartificialepisomalchromosome,HAEC)是一类发展中的MACs,它来自于Epstein-Barr病毒(1)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)基础：大肠杆菌F质粒导入宿主：电转化载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。HindIIICosNotINotIZT7SP6ParCCMrHindIII部分酶切ParBBACoriSParAPFGLrepEHindIIICIPPulsed-fieldgelelectrophoresis连接(2)P1载体和P1人工染色体(P1artificialchromosomes,PACs)基础：噬菌体P1导入宿主：体外包装和转导载体筛选：显性选择标记重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选供体DNA大小：约100kbp主要应用：大基因组分析评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。(3)酵母人工染色体(yeastartificialchromsomes,YACs)基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS导入宿主：转化酵母原生质体载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复)重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：2000kbp主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。CEN4EcoRIARSISUP4TRPIAmpURA3DNAoriEcoRI部分酶切TELTELBamHIBamHIBamHI和PFEG(pulsedfieldgelEcoli双酶切electrophorcsis)脉冲电泳变角电场电泳连接三、几种cDNA文库的介绍经典cDNA文库全长cDNA文库均一化cDNA文库差减cDNA文库(SubtractivecDNAlibrary)全长差减均一化cDNA文库固相cDNA文库构建（一）经典cDNA文库构建的基本原理用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：（1）RNA的提取