高通量测序在动植物育种领域的应用-201409

NGS在动植物育种领域的应用2014-9-23华大科技孙艳萍目录•背景介绍•基因挖掘•分子机制研究分子育种•育种的核心就是发现或创造遗传变异，通过育种选择出具有优异性状的后代个体。•分子育种就是借助分子生物学的手段，改良物种的遗传物质，发现或创造遗传变异。基因型&表型育种的关键就是选择在表现优异的基因型ErtaoWangetal.NatureGenetics,2008(11),40,1370-1374ErtaoWangetal.NatureGenetics,2008(11),40,1370-1374GIF1基因控制水稻灌浆和产量qSH1基因，控制水稻脱粒NGS与分子育种基因挖掘基因挖掘策略—高通量测序突变体比较分析作图群体连锁分析自然群体关联分析选择分析（群体进化）测序深度的影响基因组的覆盖率为1-e-c，c为测序深度。作图群体研究方案作图群体BinMap构建DH、RIL作图亲本测序20X，子代建议平均测序深度0.1X。高粱、玉米等重复序列高的物种子代平均测序深度0.2X。无参考基因组构建遗传图谱摘自：JWu,ZWWang,ZBShi,etal.Thegenomeofpear(PyrusbretschneideriRehd.).GenomeResearch,2013,23:396-408辅助基因组组装；QTL定位QTL检测功效与标记密度、群体大小摘自：李慧慧,etal.数量性状基因定位研究中若干常见问题的分析与解答.作物学报,2010,36(6):918−931以谷子不育材料A2为母本，张谷为父本，杂交得到F2群体537株；对张谷材料进行Denovo测序，A2进行了10x全基因组重测序；构建700个SV标记高密度遗传连锁图，完成了杂交谷株高、雄性不育、抗除草剂、叶色等七个重要农艺性状控制基因的定位；从F2群体中选出含有绿叶基因且其余遗传背景偏向A2的植株，与A2进行数次回交和自交纯化。MAS选择最终得到绿叶A2雄性不育系材料。A2和改良后A2材料MAS选择ZhangG,LiuX,QuanZ,etal.Genomesequenceoffoxtailmillet(Setariaitalica)providesinsightsintograssevolutionandbiofuelpotential.NatureBiotechnology,2012,30(6):549-54.点突变研究方案野生型AEMS/ENU的等诱变突变体野生型A高深度测序（30X）比较检测SNP突变位点XF1F2突变型野生型高深度测序（30X）20个体混合测序（30X）检测引起表型变化的SNP突变位点野生型BXF1F2突变型野生型XX50个体混合测序（30X）定位引起表型变化的候选基因区间213654AbeA,KosugiS,YoshidaK,etal.GenomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingMutMap.Naturebiotechnology,2012,30(2):174-178•背景：水稻品种Hitomebore的突变体(叶子浅绿色)Hit1917-pl1和Hit0813-pl2与野生型杂交，构建F2群体;•从200个F2群体中，选择20个具突变表型子代混合测序12X;•在突变体Hit1917-pl1和Hit0813-pl2分别检测到1001和1339个G→A/C→T)的突变位点。Hit1917-pl1在10号染色体检测到一个包含7个SNP的集合，一个SNP位于基因OsCAO1的编码区，使得植株叶绿素含量降低；Hit0813-pl2在1号染色体上检测到一个包含5个SNP的集合；1245TakagiH,AbeA,YoshidaK,etal.QTL‐seq:rapidmappingofquantitativetraitlociinricebywholegenomeresequencingofDNAfromtwobulkedpopulations.ThePlantJournal,2013,74(1):174-183.•背景：水稻稻瘟病抗性品系Nortai和Hitomebore杂交衍生RIL群体；•241株RIL群体抗性鉴定，20个抗性和20个易感性植株分布混合测序6.88x；•Nortai和Hitomebore间检测到161,563SNPs，利用QTL-seq检测这些SNP在混合样本中的SNP-index值，在6号染色体2.39-4.39Mb检测到混合样本间index值差异显著，与抗性相关。利用芯片分型进行连锁分析验证了此结果。QTL作图功效与选择比例、标记密度YPSun,JKWang,JHCrouch,etal.Efficiencyofselectivegenotypingforgeneticanalysisofcomplextraitsandpotentialapplicationsincropimprovement.MolecularBreeding,2010,26:493–511Populationsize=250populationsize=500自然群体研究方法群体进化全基因组关联分析样本选取提取基因组DNAHiSeq2000测序芯片扫描SNP检测；群体结构分析；与目标性状相关的GWAS分析;连锁不平衡分析；筛选与性状相关的候选基因；数据全基因组低深度RAD/GBS芯片摘自：HLi,ZYPeng,XHYang,etal.Genome-wideassociationstudydissectsthegeneticarchitectureofoilbiosynthesisinmaizekernels.NatureGenetics,2013,45,43–50群体结构影响GWAS分析结果GWAS主效QTLN不同的alleleGWAS主效QTLNMorrisGP,etal.Populationgenomicandgenome-wideassociationstudiesofagroclimatictraitsinsorghum.PNAS,2013,110(2):453–458.971份遍布全球，适应于不同农业气候条件的高粱品种ApeKI酶切，GBS测序获得21G的测序数据获得265,487个SNP，分析发现高粱LD值平均在150Kb内下降到一半；利用其中336个高粱品系，通过GWAS分析定位到多个与株高相关的已知基因位点，同时定位到多个与花序结构相关的候选基因位点。连锁分析与关联分析物种进化示例群体进化分析内容材料选择•样品数量30个以上•物种内亚群的划分明确，且相同亚群的个体具有一定的代表性建库•小片段文库测序•每个样品全基因组重测序5X-10X信息分析•连锁不平衡分析•群体进化分析•群体结构分析•选择分析•主成分分析等群体进化-选择分析摘自：XiaQ,GuoY,ZhangZ,etal.Completeresequencingof40genomesrevealsdomesticationeventsandgenesinsilkworm(Bombyx).Science,2009,326(5951):433-436.选择性清除区域θπ值低，LD大，Fst值大—受选择基因注释育成动植物驯化研究 810101111810118家鸡的现代野生型祖先和8个品系的家鸡，每个品系选择8-10个个体进行pooling测序，平均每个个体0.5X；利用驯化区群体杂合度降低，及与祖先redjungle遗传距离增加的特点，在家鸡的基因组上分析筛选出家鸡驯化的关键基因(TSHR)；用同样的方法，找到肉鸡驯化的关键基因。分子机制研究测序在中心法则过程中的应用高通量测序在RNA水平应用DNARNAmRNAmiRNAlncRNA转录组组装转录组Re-SeqRNA-SeqlncRNA-SeqmiRNA-Seq组装Unigene功能注释预测CDS差异表达基因检测功能注释SNPSSR差异表达基因检测功能注释基因结构优化可变剪切新转录本预测SNP差异表达基因检测功能注释miRNA与各功能元件的比对miRNA检测miRNA靶基因预测差异miRNA检测与mRNA联合分析lncRNA鉴定lncRNA定量及差异表达分析lncRNA功能预测与mRNA联合分析基因表达研究逆境胁迫对基因表达的影响侵染后基因表达变化组织发育调控研究获得全转录组信息全面揭示真菌侵染发病机制分子标记开发转录本差异与进化研究次生代谢通量研究正常与逆境胁迫下成对样本侵染变化的时序样本组织发育的时序样本多环境条件下样本多组织样本RNA测序分析（转录组、表达谱）qPCR、FISH、ArrayCGH、高密度SNPArray基因敲除、敲低或过表达，转基因小鼠研究目的样本选择测序分析技术验证功能验证FuB,HeS.TranscriptomeAnalysisofSilverCarp(Hypophthalmichthysmolitrix)byPaired-EndRNASequencing.DNAResearch.2012,19:131–142•长江野生鲢鱼，样品取自心脏，肝脏，大脑，脾脏和肾脏，混合RNA提取•转录组测序大约2G•组装、unigene功能注释、SSR检测、正选择基因检测功能注释组装5个正选择基因分析流程JakhesaraSJ,KoringaPG,JoshiCG.IdentificationofnovelexonsandtranscriptsbycomprehensiveRNA-SeqofhorncancertranscriptomeinBosindicus.JournalofBiotechnology.2013,165(1):37-44差异表达基因•正常和角癌瘤牛的牛角核粘膜•454转录组测序正常和角癌瘤牛分别测得920,450和584,450reads•比对和组装、鉴定新转录本、差异表达基因检测、RT-PCR和RT-qPCR确定预测的新转录本和差异表达新转录本、差异表达基因功能和功能聚类分析项目取材DuH,BaoZ,HouR,etal.TranscriptomeSequencingandCharacterizationfortheSeaCucumberApostichopusjaponicus(Selenka,1867).PLoSOne.2012,7(3):e33311.•不同生长时期不同组织部位的仿刺参•454转录组测序•组装、功能注释、开发SSR和SNP仿刺参与紫色球海胆在GO条目呈现上特征相似IdentificationandprofilingofconservedandIdentificationandprofilingofconservedandnovelmicroRNAsfromChineseQinchuanbovinelongissimusthoracis.BMCGenomics.2013,14:42.•胚胎期和成年牛的背最长肌RNA，提取小RNA，进行测序•小RNA测序•鉴定已知和新的miRNA；不同组织及不同胚胎时期的miRNA表达水平、RT-QPCR验证成年牛和牛的胎儿中不同的miRNA表达水平GJZhang,GWGuo,XuedaHu,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeRes.May2010;20(5):646–654.•水稻8个组织（愈伤组织、幼苗芽、幼苗根、分蘖期叶、开花期叶、初期花序、开花花序、饱满花序）•2个转录组测序、8个表达谱、混合样本小RNA测序•新转录本预测、新小RNA预测、组织特异性转录本和新转录本、基因注释、检测小RNA前体新转录本差异分析可变剪切基因融合lncRNA-mRNA-miRNANetwork摘自：TheNoncodingRNAExpressionP