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第六章细胞的冻存、复苏与运输细胞冷冻、复苏的发展历史简介1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。到了1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存的事实。1949年，Polge等人发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用。Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现电解质浓度增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。1959年，Lovelock等人发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的二甲基亚砜(DMSO)。当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术，贮存时间几乎是无限的。一、培养物的冷冻保存与复苏原理冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。无论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤溶质损伤冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。保护机理：冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成；通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。影响冷冻效果的因素有以下几点：1.冷冻速率不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时:细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时:细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。2.冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。如-70℃冻存SNL细胞(一种小鼠成纤维细胞)，一个月内复苏，细胞存活率在90%以上；但一个月后，细胞存活率却降至50%左右；若时间再延长，细胞存活率更低甚至为零。不同细胞的最适冷冻速率不同。例如，小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。3.复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是:在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！在复苏时，一般以很快的速度升温，1～2min内恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。4.冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。分为：渗透性：常用甘油、DMSO非渗透性甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。保护机制:在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。注意：由于许多冷冻保护剂(如DMSO))在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。二、冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后投入液氮进行保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冷冻则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）1.主要材料(1)仪器设备：普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。(2)冻存管：容量为1ml或1.5ml。(3)冷冻保护液：一般是以含20%小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜1份以9：1混合而成。现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。(4)待冻存细胞：各种肿瘤细胞2.冻存过程(1)待冻存细胞悬液的准备①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。②将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。④按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。⑤在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。(2)分级冷冻：（有几种方法可以使用）①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min。②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下过夜。⑤最后将冻存小管投入液氮保存。还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。(3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。3.冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。注意事项：在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮从液氮罐内溅出。应注意控制冻存细胞的质量。勿将冻存的细胞放置在0～-60℃这一温度范围内过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。三、非玻璃化冻存细胞的复苏1.主要材料(1)仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。(2)培养用液：完全培养液（20%血清+基础培养液）2.复苏过程1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。但对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO。3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。4)将细胞悬液经800～1000r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。四、细胞运送一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦。二是充液法运输，比较简便。充液法运输操作如下：1.选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落2.妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响;3.到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养箱中，次日传代。