琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

实验三琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化一、实验目的1、掌握琼脂糖凝胶制备方法2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法3、掌握PCR产物回收和纯化方法二、实验原理根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出荧光，既可以确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度很高，少至1～10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围凝胶中琼脂糖含量（%）线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～7.01.20.4～6.01.50.2～3.02.00.1～2.0琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填充到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低pH下，吸附DNA，在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。此外还有玻璃奶（Glassmilk法），冻融法等方法回收纯化DNA。三、主要实验仪器和试剂主要仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。主要实验试剂:1、50×TAE（2MTris，1M醋酸，50mMEDTA（pH8.0））2、10×上样缓冲液（loadingbuffer）3、分子量标准DNAMarker4、琼脂糖5、EB（溴化乙锭）（黑暗保存）6、DNA回收纯化试剂盒（AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒）四、实验步骤琼脂糖凝胶的制备：1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；2、用1×TAE电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解；3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时，加入EB（浓度约0.025ug/mL）,搅拌均匀。缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；4、插入梳子，静待琼脂糖凝固；5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶约5mm；6、小心拔掉梳子，用20ul移液器吸取DNA溶液（20ulDNA加2～3ul10×loadingbuffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加4ulDNAMaker；7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳20～30分钟；8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，置于紫外灯下观察。PCR产物切胶回收：1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！）2、加入3个凝胶体积的BufferDE-A（600ul），混合均匀后，于65°C加热，直至凝胶完全熔化。3、加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B（300ul）,混合均匀，当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管中），12，000×g离心1min。弃滤液。5、将制备管置回2ml离心管中，加500ulBufferW1，12，000×g离心30sec，弃滤液。6、将制备管置回2ml离心管中，加700ulBufferW2,12，000×g离心30sec，弃滤液。重复一次。7、将制备管置回2ml离心管中，12，000×g离心1min。彻底去除残余的液体。8、将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央，加25～30ul65°CEluent或去离子水，室温静置1min。12，000×g离心1min洗脱DNA。思考题：1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？