猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定

生物工程学报ChinJBiotech2008,August25;24(8):1490-14[e-mail]©2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:July26,2007;Accepted:March13,2008Supportedby:theGansuProvincialFundforHigh-techSmallandMedium-sizedEnterprises(No.2GS055-A43-057).Correspondingauthor:XuepengCai.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]甘肃省科技型中小型企业技术创新基金(No.2GS055-A43-057)资助。技术与方法猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定张少华,贾万忠,骆学农,景志忠,吴国华,郑亚东,郭爱疆,才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046摘要:猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体,为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18,本研究采用超声破碎菌体,0.2%、2%DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9%SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后,利用透析与凝胶过滤层析技术相结合对rCE18进行复性和纯化。同时,采用GST-FF亲和柱层析及SDS-PAGE胶回收蛋白两种方法纯化rCE18,比较三者的纯化效果。并通过间接ELISA检测复性蛋白的生物学活性。结果表明:经透析与凝胶层析复性纯化后的rCE18蛋白的纯度可达到60%以上,活性回收率为41.3%,间接ELISA证实,复性后的rCE18蛋白能特异性识别猪囊虫阳性血清,检测敏感性高达97.2%,与全囊虫抗原检测的符合率为100%。本试验初步建立了猪囊尾蚴rCE18包涵体纯化及复性的有效方法,为猪囊尾蚴rCE18蛋白的诊断应用奠定了基础。关键词:猪囊尾蚴,CE18重组蛋白,复性,纯化,透析,凝胶过滤层析Renaturation,PurificationandAntigenicityIdentificationofRecombinantProteinofCysticercuscellulosaeExpressedinEscherichiacoliShaohuaZhang,WanzhongJia,XuenongLuo,ZhizhongJing,GuohuaWu,YadongZheng,AijiangGuo,andXuepengCaiKeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,ChinaAbstract:Toobtaintherecombinant18kDproteinwithhighpurityandnormalbioactivityofCysticercuscellulosae(rCE18),E.colicellswiththerCE18weredisruptedultra-sonically,andtheinclusionbodieswerewashedwithasolutioncontaining0.2%deoxycholicacidsodium(DOC)and2%DOC,respectively.Thentheyweredenaturedwith0.9%sodiumlauroylsarcosine(SKL)followedbydialysisandgelfiltrationtorefoldandpurifythetargetprotein.Atthesametime,thismethodwascomparedwithGST-FFaffinitychromatographyandrecoveringfromSDS-PAGEgel.BiologicalactivityofpurifiedrCE18wasanalyzedwithindirectELISA,andthepurityoftheproductswasidentifiedusingSDS-PAGE.Thepurityofrefoldedinclusionbodiesexceeded60%andthetotalrecoveryofactivatedproteinrCE18wasabout41.3%.ThespecificityofrCE18reachedupto97.2%usingindirectELISA.AneffectivewayforpurifyingandrefoldingrCE18expressedinE.coliasinclusionbodieswasestablished.rCE18withhigherpurityandactivitywasobtained,whichhasthepotentialfordevelopingdiagnosismethodsofporcinecysticercosis.Keywords:Cysticercuscellulosae,rCE18,renaturation,purification,dialysis,gelfiltrationchromatography张少华等:猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定1491Journals.im.ac.cn近年来在寄生虫研究领域,重组蛋白作为疫苗和诊断抗原,因其特异性好,可以大量制备等优点而占据非常重要的地位。原核表达系统已能高水平表达多种寄生虫蛋白,但多以包涵体(Inclusionbody,IB)的形式存在[1],需要将表达的包涵体蛋白在体外重折叠转化为具有天然构象的生物学活性蛋白。猪囊尾蚴CE18是与猪囊尾蚴病特异诊断相关的抗原分子,而且本实验室已成功构建、筛选出了高表达量的猪囊尾蚴18kD重组菌株,但其表达蛋白也以包涵体形式存在[2]。本试验针对包涵体蛋白复性回收率低、容易凝集的难点,探索了猪囊尾蚴CE18包涵体蛋白的体外优化复性及纯化方法,以期为今后猪囊尾蚴病诊断抗原的工艺化生产提供有效途径。1材料和方法1.1材料1.1.1菌种表达宿主菌BL21(DE3)为Novagen公司产品。pGEX-4T-1-CE18表达质粒由本实验室构建并保存。1.1.2试剂DOC(脱氧胆酸钠),SKL(十二烷基肌氨酸钠),DTT(二硫苏糖醇),IPTG,Tryptone,YeastExtract,蛋白marker,氧化型/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)及兔抗猪IgG-HRP购自上海生物工程有限公司。GST-FF填料购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司。其他常用试剂均为国产分析纯。1.1.3仪器VCX500型超声波破碎仪(USA),蛋白检测仪(Eppendorf),ÄKTAPrimePurifier层析系统(Amersham),Ultra15(30kD)超滤管(Millipore),GeBAflex-tube透析管(Israel),高速低温离心机(Beckman),凝胶成像仪(Millipore),垂直板电泳系统(DYY-Ⅲ型,北京六一仪器厂)。1.2方法1.2.1重组菌的诱导表达将复苏的重组菌接种至2×YT培养液(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37oC、230r/min进行增菌培养;至A600达0.6~1.0时,加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG,37oC诱导表达5h;收集菌体,用0.01mol/LPBS(pH7.2)悬浮洗涤沉淀3次。留样品进行SDS-PAGE分析,检测目的蛋白的表达形式。1.2.2包涵体前期处理条件的确定(1)超声波破碎时间:用25mLSolutionA(50mmol/LTris-HCl,0.5mmol/LEDTA,50mmol/LNaCl,5%甘油,0.2mmol/LDTT,pH7.9)重悬菌体,−70oC反复冻融3次,加入200μL10mg/mL溶菌酶、8μL100mmol/LPMSF及25μLTritonX-100,于30oC温育15min后,在冰浴中超声破碎菌体(功率200W,工作8s,间歇6s),分别取超声波破碎5、15及20min的菌液沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定包涵体的释放程度。(2)包涵体的洗涤:将收集的沉淀用SolutionA充分重悬,加入20%DOC贮存液,使DOC终浓度为0.2%,混匀,室温静置至少20min,4oC、13000r/min离心10min收集包涵体沉淀,如此重复洗涤3次。再以含终浓度2%DOC的SolutionA逐次洗涤包涵体蛋白,留样品进行SDS-PAGE分析,检测0.2%及2%DOC逐次洗涤纯化包涵体的效果。(3)包涵体的变性溶解:在洗涤后的包涵体中加入SolutionA及20%SKL贮存液(SKL净浓度为0.9%,剧烈搅动使沉淀慢慢溶解,室温静置约1.5h。将溶解的蛋白质悬液于4oC、13000r/min离心10min,收集上清。用紫外分光光度计测定蛋白含量,校正公式如下:蛋白含量(mg/mL)=(1.45×A280−0.74×A260)×稀释倍数[3]并对SKL溶解后的上清及沉淀进行SDS-PAGE分析,确定SKL变性溶解的效果。(4)透析复性时间的选择:以含0.2mmol/LDTT,0.3mmol/LGSSG和3mmol/LGSH的SolutionA作为复性液,将溶解的包涵体用3/4体积的复性液稀释后,装入截留分子量为8kD的透析袋中;在4oC条件下,用10倍体积的复性液进行透析,每8h换液1次,同时充分搅拌。于复性0h、12h、24h、48h、72h取样,分析蛋白的复性程度[4]。1.2.3纯化方法的选择(1)GST-FF亲和柱纯化包涵体蛋白:将1.2.2(1)中超声破菌后离心收集的上清用0.45μm滤器过滤,取适量平衡好的GST-FF填料转至过滤上清中,置摇床缓慢结合1.0~1.5h,4oC、500r/min离心5min,弃上清;将结合蛋白的GST-FF填料转至柱中,用缓冲液1(50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl,pH8.3)1492ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2008Vol.24No.8Journals.im.ac.cn至少洗10个床体积,流速1mL/min;再加入缓冲液2(50mmol/LTris-HCl,20mmol/LGSH,pH8.3)洗脱并收集目的蛋白,测定蛋白浓度,留样进行SDS-PAGE分析蛋白的纯化效果。(2)凝胶过滤层析:取透析好的rCE18蛋白经SephacrylS-300柱层析复性纯化,全部层析试验在ÄKTAPrimePurifier层析工作台完成。每次上样0.5mL,分部收集洗脱样品,经Ultra15(截留分子量30kD)超滤管浓缩后,进行蛋白含量测定,用SDS-PAGE分析其纯度及回收率。(3)SDS-PAGE胶回收包涵体蛋白:将变性处理的rCE18蛋白进行常规SDS-PAGE;电泳后采用考马斯亮兰R250-KCl染色脱色法[5]处理胶片至背景清晰,用干净刀片准确切下目的蛋白条带,放入电洗脱平衡液平衡2次;之后将胶片装入GeBAflex-tube中,装满电洗脱液,恒压100V电泳2.5~3.0h,反向接通电源120s,使膜上的蛋白回到电洗脱液中,反复吹打管中液体,并将之转移至另一干净离心管中,4oC、8000r/min离心10min,收集上清;