王镜岩生物化学-第35章 DNA的重组与基因工程

Chapter35DNA的重组与基因工程基因重组与基因工程？GeneticrecombinationChapter35DNA的重组与基因工程一、DNA的重组的分类同源重组、特异位点重组和转座重组等类型二、自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译。Chapter35DNA的重组与基因工程二、自然界的基因转移和重组1、结合作用结合作用——质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）2、转化及转导作用（1）转化作用transformation通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程（2）转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径溶原菌途径3、转座（2）转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径溶原菌途径溶原裂解2、转化及转导作用3、转座转座反向重复序列由可移动的DNA序列（插入序列和转座子）介导的基因移位或重排①插入序列转座保守性转座复制性转座反向重复序列转座酶②转座子转座转座子—可以从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列Chapter35DNA的重组与基因工程二、自然界的基因转移和重组4、基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称重组（一）位点特异的重组特异位点（二）同源重组同源序列间的重组Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术（一）重组DNA技术的相关概念1、DNA克隆克隆（clone）无性繁殖分子克隆(DNA克隆)—应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。基因克隆、DNA重组、基因工程(geneticengineering)基因克隆示意图目的基因载体DNA(限制性内切酶切开)宿主细胞重组体已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达2、工具酶常用的工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（一）重组DNA技术的相关概念限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系限制性核酸内切酶甲基化酶识别特异的位点—酶切位点回文结构4～6bp出现两种末端粘性末端粘端平头末端平端配伍末端GAATTCCTTAAGEcoRⅠCCCGGGGGGCCCSmalⅠ（一）重组DNA技术的相关概念目的基因（外源基因）cDNA逆转录基因组DNA基因工程的目的目的基因拷贝克隆载体基因表达产物表达载体3、目的基因targetDNA（一）重组DNA技术的相关概念自我复制克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）真核载体：动物病毒载体pLXSN质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒1.拷贝数多;2.两三个抗药性基因terrampr筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）（一）重组DNA技术的相关概念4、基因载体vectorpBR322EcoRⅠHindⅢBamHⅠAvaⅠPvuⅡSalⅠPstⅠOri氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术基本原理（一）目的基因获得1、化学合成法2、基因组DNA基因组DNA文库—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合3、cDNAcDNA文库4、聚合酶链式反应PCR(二)克隆载体的选择和构建(三)外源基因与载体的连接（DNA连接酶）连接方式1.粘性末端连接连接效率高相同酶切末端配伍末端2.平端连接连接效率低3.同聚物接尾法4.人工接头法Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术基本原理目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3′3′3′3′重组DNA技术简图(四)重组DNA导入受体菌基因工程菌HB101,JM109转化制备感受态细胞冷的氯化钙处理细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术基本原理(五)重组体的筛选screening/selection1.直接选择法抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补α—互补蓝白斑筛选分子杂交探针原位杂交/Southern印迹法限制性酶切图谱/PCR2.非直接选择法免疫学方法Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术基本原理(六)克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件密码子通用1、原核表达体系原核表达载体的标准合适的筛选标志强启动子翻译控制序列多克隆位点Chapter35DNA的重组与基因工程三、重组DNA技术基本原理Chapter35DNA的重组与基因工程四、重组DNA技术与医学的关系分子医学molecularmedicine（一）疾病基因的发现（二）发展生物制药基因工程药物基因工程疫苗（三）DNA诊断基因诊断基因诊断—用分子生物学的技术对引起疾病的原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析.DNA/RNAChapter35DNA的重组与基因工程四、重组DNA技术与医学的关系（四）基因治疗genetherapy基因治疗—就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。1、基因置换2、基因修正3、基因修饰产物补偿缺陷细胞4、基因失活反义技术封闭基因,抑制有害基因对象体细胞生殖细胞本章完