第三章核酸技术

第三章核酸技术•核酸的分离和纯化•核酸电泳•染色体DNA电泳•DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制•DNA的连接•PCR技术•分子杂交技术•核酸序列的测定第一节核酸的分离和纯化一、一般程序1、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)2、载体DNA分离载体DNA感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒培养转化细胞、收集菌体病毒载体DNA分离与纯化破碎细胞质粒DNA分离与纯化3、DNA片段的分离DNA限制酶切凝胶电泳分离特定DNA片段的回收4、质量评估1）凝胶电泳2）光密度值测定3）限制酶切分析二、细胞裂解1.酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。1)细菌：溶菌酶2)酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等3)丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶4)植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。2.机械法1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外）2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)反复冻融法三、DNA的分离与纯化1、供体DNA的分离与纯化要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。1)基因组大小：染色体细菌3300~4200kb酵母15,000kb果蝇1.28x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb质体几~100以上kb线粒体藻类线状15kb酵母环状19~78kb植物环状100~150kb动物(扁虫到人)环状15~18kb锥虫网状6000kb(幼体)短膜虫网状30,000kb(幼体)(Kinetoplast）叶绿体双子叶植物121（菠菜）~154kb（豌豆）单子叶植物151（玉米）~182kb（浮萍）藻类132（裸藻）~191kb（衣藻）1)DNA分离纯化过程破碎细胞+DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂)65℃温育20’冰浴冷却离心去细胞碎片苯酚抽提法①CsCl密度梯度离心②1)苯酚抽提法上清液缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥溶于缓冲液加入RNAase处理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥2)CsCl密度梯度离心上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥*两种方法比较：CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若小心操作，所获DNA亦符合要求。**上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤ⅰ.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心ⅲ.使RNA分离：RNase处理或超速离心ⅳ.使DNA与其它可溶物分离2.载体DNA的分离与纯化1)质粒载体DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型3)细胞器DNA的分离植物组织用核分离缓冲液匀浆过滤滤液离心(2000g,10’,4℃)核缓冲液使核裂解(含0.5%TritonX-100)抽提DNA植物组织细胞器缓冲液匀浆离心(100g,10’,4℃)除去细胞核离心(1800g,10’,4℃)分离叶绿体离心(10,000g,10’,4℃)分离线粒体DNase除去细胞器外DNA加入EDTA使DNase失活纯化细胞器细胞器裂解提取DNA方法：ⅰ.超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型ⅱ.变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNARF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）2)噬菌体载体DNA的分离纯净病毒颗粒病毒载体DNAM13mp载体可采用质粒DNA的分离方法二、RNA的分离与纯化1.制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂2)解决办法：外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等2.总RNA的制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。3.多聚核糖体RNA的制备1)多聚核糖体的分离①超速离心法（30-40万g，离心2-3h）②镁盐沉淀法（0.1MMg++）③分级分离法—分离特异性多聚核糖体i.结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的多聚核糖体iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法新生肽链+抗体蔗糖密度梯度离心**间接免疫沉淀法新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗）不可溶复合物离心分离***免疫亲和层析法新生肽链-抗体复合物不溶性交联抗原基质亲和层析柱吸附洗脱免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶2)多聚核糖体RNA的分离纯化多聚核糖体+SDS蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提4.RNA的分级分离1)分子量大小分级分离i.蔗糖密度梯度离心ii.凝胶电泳2)核酸序列分级分离i.分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离DNA分子变性结合到NCFRNA·DNA杂交洗涤洗膜乙醇沉淀ii.亲和层析法：低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA；多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（20A）RNA进样吸附洗涤洗脱收集260nm处吸收峰样品乙醇沉淀iii.无poly(A)mRNA的分离纯化多聚核糖体核糖体亚基+mRNP离心mRNP蛋白酶KmRNA低聚（dT）纤维素层析洗出液乙醇沉淀（无多聚AmRNA）5.RNA的质量评估方法1)光密度值测定法A260/A280=2.02)凝胶电泳3)体外蛋白质翻译细胞裂解物胍盐法总RNA分子杂交法—特异RNA分子热苯酚法凝胶电泳围RNA大小分级分离大小范蔗糖密度梯度离心一定LiCl/核酸序列尿素法离心分级分离亲和层析法—poly（A）RNA分子高速离心法全部多聚核糖体上清液镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心—结合与游离多聚核糖体分级分离法蔗糖连续密度—一定范围大小核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法——特异性多聚核糖体第二节核酸电泳1.种类1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易2.用途琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序制胶点样电泳染色观察二、DNA电泳1.DNA分子种类1)线状DNA—单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定2)环状DNA—单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）3)线状ds-DNA电泳—使用频率最高的一种电泳这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：i.分子量的大小:迁移距离与分子量的常用对数成反比ii.凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNAiii.电压:低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。iv.碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。4)环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定5)线状ss-DNA电泳链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。DNA双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。核酸定序凝胶(染料指示剂)：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）三.RNA凝胶电泳方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合50℃、1h变性点样电泳染色观察2.羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上电泳染色观察3.甲醛法步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上MOPS缓冲液电泳染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.三种方法的比较第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。五、蛋白质电泳方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。五、核酸片段的分离与回收1.方法—用于DNA、RNA以及蛋白质的回收1)电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；2)滤纸法—核酸凝胶染色长波紫外光确定位置在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)电泳至DNA带全部进入滤纸条洗脱DNA纯化、沉淀3)透析袋法—切下含DNA带琼脂块放入透析袋，封口放入电泳槽电泳2~3小时至全部DNA离开凝胶块反向电泳1分钟取出DNA液纯化、沉淀4)冻融法5)酶解法待回收DNA切口DNA切口凝胶块滤纸法透析袋凝胶块待回收DNA透析袋法待回收DNA凝胶块V-型槽电洗脱槽法回收DNA方法2.影响回收率的因素1）DNA分子大小—回收率与分子量大小呈负相关；2）乙醇沉淀—其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关；3）离心时间—时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。3.回收DNA片段质量凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。第三节染色体DNA电泳一、DNA分子在凝胶电泳中的移动1、常规电泳在自由电场中，DNA的移动速度与分子量大小无关；将DNA分子置于凝胶中进行电泳，DNA移动距离与分子量有关。分子量小的移动快；反之则慢。大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。2、脉冲场凝胶电泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，PFGE)PFG工作假说1)DNA