甲／戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达

云南大学学报（自然科学版），２００８，３０（２）：２０２～２０６犆犖５３－１０４５／犖犐犛犛犖０２５８－７９７１犑狅狌狉狀犪犾狅犳犢狌狀狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔甲／戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达奎翔，李鸿钧，谢天宏，张光明，刘馨，易山，杨芳，彭梅，马开利，孙茂盛（中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室，云南昆明６５０１１８）摘要：将甲肝病毒狏狆１编码基因（犪犪２４～１７１）和戊型肝炎病毒犗犚犉２基因（犪犪４３１～６１５）通过一段编码柔性甘氨酸链（犌犾狔４犛犲狉犌犾狔４）的基因片断连接，获得编码犎犃犞／犎犈犞融合蛋白基因（犃犈犃犵３４２）．将该融合基因插入质粒狆犅犞２２０，构建表达质粒狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２．将狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２转化入大肠杆菌犅犔２１中进行表达，表达量约占菌体总量的２０％，经离子交换层析纯化，目的蛋白纯度达９０％以上．犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映，为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础．关键词：甲型肝炎病毒；戊型肝炎病毒；基因克隆；表达；类病毒颗粒中图分类号：犙７８９文献标识码：犃文章编号：０２５８－７９７１（２００８）０２－０２０２－０５戊型肝炎病毒是引起肠道传播的非甲非乙型肝炎（即戊型肝炎，犎犈）的病原体．由于尚未建立起有效的细胞培养模型或简便的病毒增殖模型，难以进行传统的灭活疫苗或减毒疫苗的研制，基因工程疫苗的研制成为各国学者研究的焦点，而其犗犚犉２羧基末端能自发形成类病毒颗粒（犞犔犘），成为研制基因工程疫苗的首选靶点．犎犃犞与犎犈犞从分子病毒学到流行病学及其引起的临床症状都有许多相似之处，甲戊双价疫苗和联合检测试剂盒的开发有助于甲肝及戊肝的预防和早期诊断．犎犈犞的中和表位主要位于犗犚犉２的犆端［２］，其氨基酸序列比较保守．能结合犎犈犞中和抗体的最小犗犚犉２片段位于犪犪４５２～６１７之间，该片段不仅能引发中和抗体，还能与其他型别的抗体发生交叉反应［３］．犎犃犞只有一个血清型，虽然有多个基因型，但它们的主要差别在５′犖犜犚区，其编码蛋白区是保守的［４］．犎犃犞狏狆１的抗原表位则位于犪犪１～２２１之间［５］．本研究选取了犗犚犉２犪犪４３１～６１５及狏狆１犪犪２４～１７１之间的多肽作为研究对象，表达融合蛋白犃犈犃犵３４２，以期能形成嵌合犞犔犘，提高犗犚犉２和狏狆１的抗原性．１材料和方法１．１菌株和质粒大肠杆菌犇犎５α，犅犔２１及质粒狆犅犞２２０，含有犎犈犞犗犚犉２的质粒狆犈犎犌２及含有犎犃犞狏狆１的质粒狆犎犃犞－１均由本室保存．１．２试剂犘犳狌犇犖犃聚合酶、限制性内切酶犛犪犾Ⅰ，犈犮狅犚Ⅰ及犜４犇犖犃连接酶购自犜犪犓犪犚犪犅犻狅公司；犘犆犚产物快速回收试剂盒购自犜犐犃犖犌犈犖公司；质粒抽提试剂盒购自犠犪狋狊狅狀犅犻狅公司；辣根过氧化物酶（犎犚犘）标记的山羊抗人犐犵犌购自武汉博士德生物工程公司；人抗犎犃犞，犎犈犞血清来自昆明传染病医院甲型及戊型肝炎患者；其他试剂均为国产分析纯．１．３重组基因片断的扩增设计犎犈犞犗犚犉２犪犪４３１～６１５（犎犈犃犵１８５）基因扩增引物犘１，犘２，在正向引物犘１引入酶切位点犈犮狅犚Ⅰ及起始密码子犃犜犌（下划线部分），反向引物犘２引入甘氨酸连接肽（犌犾狔４犛犲狉犌犾狔４，下划线部分）：犘１：５′－犃犌犜犌犃犃犜犜犆犃犜犌犃犜犆犌犃犆犆犜犆犌犌犌犌犃犃犜犆犜犆－３′；犘２：５′－犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犜犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犆收稿日期：２００７－１１－２０基金项目：云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金资助（２００５犘犢０１－２４）．作者简介：奎翔（１９８０－），男，云南人，硕士生，主要从事生物化学与分子生物学方面的研究．通讯作者：李鸿钧（１９６９－），男，云南人，副研究员，主要从事分子生物学方面的研究，犈－犿犪犻犾：犾犻犺犼６９１２＠犺狅狋犿犪犻犾．犮狅犿．犌犜犆犆犃犜犌犌犜犃犜犆犆犜犆犃犃犌犆犃犃犜－３′．根据犖犆犅犐公布的犎犃犞（犎犕１７５株）狏狆１犪犪２４～１７１（犎犃犃犵１４８）的基因序列，设计引物犘３，犘４，正向引物犘３引入与犘２互补的甘氨酸连接肽序列，反向引物犘４中引入酶切位点犛犪犾Ⅰ及终止密码子（下划线部分）：犘３：５′－犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犃犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犃犜犃犃犆犃犃犆犆犃犜犌犃犃犃犌犃犜犜犜犌－３′；犘４：５′－犆犃犌犜犆犌犃犆犜犜犃犜犃犆犆犆犃犃犌犌犃犌犜犃犜犆犃犃犆犌犌－３′．以狆犈犎犌２为模板，用引物犘１，犘２扩增犎犈犃犵１８５，５０μ犔反应体系如下：１×反应缓冲液（含１．５犿犿狅犾／犔犕犵犆犾２），模板１狆犵，引物各１μ犿狅犾／犔，４×犱犖犜犘０．２犿犿狅犾／犔，狆犳狌酶２犝．反应条件：９７℃预变性５犿犻狀进入循环，９７℃变性４０狊，５４．３℃３０狊，７２℃１犿犻狀，循环２９次，最后９７℃变性１犿犻狀，５３．３℃３０狊，７２℃１０犿犻狀．再以质粒狆犎犃犞－１为模板，用引物犘３，犘４扩增犎犃犃犵１４８基因，５０μ犔反应体系如下：１×反应缓冲液（含１．５犿犿狅犾／犔犕犵犆犾２），模板１狆犵，引物各０．５μ犿狅犾／犔，４×犱犖犜犘０．２犿犿狅犾／犔，狆犳狌酶２犝．反应条件（降落犘犆犚）：９７℃预变性５犿犻狀，９７℃变性４０狊，复性温度６０～５５℃，每减１℃循环２次，５５℃循环５次，５３℃循环５次，每个循环的延伸温度为７２℃，１犿犻狀，最后７２℃延伸１０犿犻狀．用上述犘犆犚产物各取５μ犔进行１％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收．然后借助２个扩增基因之间甘氨酸连接肽互补区，利用重组犘犆犚，即重叠延伸剪接术（犛狆犾犻犮犻狀犵犫狔狅狏犲狉犾犪狆犲狓狋犲狀狊犻狅狀，犛犗犈）拼接和扩增犎犃犃犵１４８－肽－犎犈犃犵１８５（犃犈犃犵３４２）［６］．５０μ犔反应体系如下：１×反应缓冲液（含１．５犿犿狅犾／犔犕犵犆犾２），模板犎犃犃犵１４８和犎犈犃犵１８５各１狆犵，引物犘１，犘４各０．５μ犿狅犾／犔，４×犱犖犜犘０．２犿犿狅犾／犔，狆犳狌酶２犝．反应条件同上述降落犘犆犚．扩增产物犃犈犃犵３４２经１％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收．１．４重组表达质粒狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２的构建上述纯化的扩增产物犃犈犃犵３４２经犈犮狅犚Ⅰ／犛犪犾Ⅰ双酶切，犜４犇犖犃连接酶连接于经上述双酶切的狆犅犞２２０载体，转化大肠杆菌犇犎５α．抽提质粒，经犈犮狅犚Ⅰ／犛犪犾Ⅰ双酶切鉴定重组子，阳性重组子送上海生工公司测序．１．５重组基因工程菌的诱导表达将筛选的阳性重组子转化大肠杆菌犅犔２１，挑取单菌落，接种于含犃犿狆（１００μ犵／犿犔，下同）的犔犅培养基中，３０℃振荡培养过夜．次日按１％接种于新的犃犿狆＋培养基培养至犃６００狀犿达０．４～０．６时迅速升温至４２℃继续培养．分别于０，２，４，６犺取样，同时以空载体菌诱导为对照，１０％犛犇犛－犘犃犌犈．１．６目的蛋白表达形式的鉴定收集诱导表达的重组菌，冰浴超声破菌：２００犠，３０狊，间隔１５狊，全程１５犿犻狀．１２０００×犵离心收集上清和沉淀，１０％犛犇犛－犘犃犌犈，分析目的蛋白表达形式．沉淀分别经３犿狅犾／犔尿素和１％犜狉犻狋狅狀－１００洗涤，再溶于含８犿狅犾／犔尿素的犜狉犻狊－犆犾缓冲液（狆犎８．０）过夜．１．７重组蛋白的纯化和复性将溶解的包涵体上犇犈犃犈柱，收集穿透峰，０．６犿狅犾／犔犖犪犆犾梯度洗脱，时间２犺．收集各峰，犛犇犛－犘犃犌犈分析．将穿透峰狆犎值调至６．５，上犆犕柱，０．６犿狅犾／犔犖犪犆犾梯度洗脱，时间２犺，收集穿透峰和洗脱峰，犛犇犛－犘犃犌犈检测，薄层扫描鉴定蛋白纯度．将所得目的蛋白用尿素梯度透析复性，最后以狆犎８．０的２５犿犿狅犾／犔犜狉犻狊－犎犆犾溶液透析，用犘犈犌２００００浓缩．１．８犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋分析将复性后的重组蛋白犃犈犃犵３４２进行１０％犛犇犛－犘犃犌犈，电转移至硝酸纤维膜上，以５犵／犔脱脂奶粉封闭２犺．分别以甲肝及戊肝患者阳性血清及健康人血清为一抗，犎犚犘标记的羊抗人犐犵犌为二抗，进行重组蛋白的免疫印迹分析．２实验结果２．１犃犈犃犵３４２基因的扩增经重叠延伸犘犆犚扩增得到的犃犈犃犵３４２基因片断长度约为１０４９犫狆，与预期大小一致．２．２狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２的克隆和筛选将犘犆犚扩增的目的片断克隆于狆犅犞２２０载体后，经犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切鉴定，证明目的片断已克隆至狆犅犞２２０载体上，见图１．２．３犇犖犃序列测定将阳性重组子送上海生工公司测序，其结果表明插入重组表达质粒狆犅犞２２０的犃犈犃犵３４２序列与预期一致，读码框架正确．２．４重组工程菌的诱导表达及表达方式的鉴定收集诱导前后的细菌及超声破菌的上清和沉淀，进３０２第２期奎翔等：甲／戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达行犛犇犛－犘犃犌犈全菌体电泳，结果显示在分子质量３６犽狌处有明显新蛋白带，表明重组的工程菌能表达外源目的蛋白．凝胶经薄层扫描分析，表达蛋白占细菌总蛋白的２０％，分子质量约为３６犽狌，与预期相符．诱导菌体经超声破菌后，犛犇犛－犘犃犌犈电泳分析，目的蛋白主要以包涵体形式存在，见图２．２．５重组蛋白的纯化及复性经犇犈犃犈柱和犆犕柱纯化后的重组蛋白犃犈犃犵３４２在分子质量３６犽狌处有１条带，薄层扫描，其纯度达９０％，见图３．２．６犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋鉴定检测结果显示，重组蛋白犃犈犃犵３４２与甲肝及戊肝患者阳性血清有良好的免疫反应，而与阴性血清不发生反应，见图４．１：犇犖犃分子量标准；２：犎犃犃犵１４８；３：犎犈犃犵１８５；４：犃犈犃犵３４２；５：犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切重组质粒狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２图１狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２酶切鉴定犉犻犵．１犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犿犪狆狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犞２２０－犃犈犃犵３４２１：蛋白分子质量标准；２：４２℃诱导６犺的空载体菌株；３～６：４２℃分别诱导０，２，４，６犺的重组犈．犮狅犾犻；７，８：重组犈．犮狅犾犻４２℃诱导６犺后的超声上清和沉淀图２犛犇犛－犘犃犌犈检测目的蛋白表达犉犻犵．２犛犇犛－犘犃犌犈狆狉狅犳犻犾犲狅犳犲狓狆狉犲狊狊犲犱犃犈犃犵３４２狆狉狅狋犲犻狀１：蛋白分子质量标准；２：溶于８犿狅犾／犔尿素的包涵体；３：经犇犈犃犈－犛犲狆犺犪狉狅狊犲离子交换层析纯化的目的蛋白；４：经犆犕－犛犲狆犺犪狉狅狊犲离子交换层析纯化的目的蛋白；５：复性浓缩后的犃犈犃犵３４２图３犃犈犃犵３４２的纯化及复性犉犻犵．３犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狉犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀狅犳犃犈犃犵３４２１，３，５：蛋白分子质量标准；２：人抗犎犃犞阳性血清与犃犈犃犵３４反应；４：人抗犎犈犞阳性血清与犃犈犃犵３４２反应；６：阴性血清与犃犈犃犵３４２反应图４犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测犃犈犃犵３４２与犎犃犞／犃犈犞患者阳性血清的免疫反应性犉犻犵．４犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋狅犳犃犈犃犵３４２狑犻狋犺犺狌犿犪狀－犪狀狋犻－犎犃犞／犎犈犞狆狅狊犻狋犻狏犲狊犲狉犪４０２云南大学学报（自然科学版）第３０卷３讨论到目前为止，国内还没有商业化的戊型肝炎疫苗和相关的二价疫苗问世，研究表明戊型肝炎疫苗的中和表位主要位于犗犚犉２的羧基末端［２］．犜狊犪狉犲狏等用昆虫杆状病毒表达系统表达犎犈犞犗犚犉２的犪犪１１２～６６０片段时，发现目的蛋白在表达过程中被剪切为５５犽狌蛋白（犪犪１１２～６０７）和５３犽狌蛋白（犪犪１１２～５７８），并且可以形成类病毒颗粒结构，具有良好免疫原性［７］．董晨、葛胜祥等分别在原核中表达了犗犚犉２犆端片断（犪犪４５２～６１７和犪犪３６８～６０６），均能形成犞犔犘［８，９］，与５５犽狌蛋白相比，犆端几乎完全重叠，而犖端缺失，说明犗犚犉２犆端是形成犞犔犘的关键区域．由于犞犔犘疫苗通常易于被抗原呈递细胞（犃犘犆）吞噬呈递，从而诱导较强