搜索
蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝结合法）一、实验目的：蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。蛋白质浓度测定方法1.凯氏定氮法2.双缩脲法3.Folin-酚法4.紫外光吸收法5.考马斯亮蓝结合法6.BCA法二、实验原理：考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在5～100μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为5～100μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。（1）分析天平、台式天平（2）具塞刻度试管（3）吸管（4）研钵（5）漏斗（6）离心机、离心管（7）容量瓶（8）微量取样器（9）分光光度计三、主要仪器：四、试剂：（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100μg／ml的原液。（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。（3）样品液取牛血清白蛋白（100ug／ml）溶液稀释质一定浓度。或用新鲜绿豆芽制备五、操作：1．标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在lh内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。操作项目管号1234567标准蛋白质溶液(ml)00.10.20.30.40.60.8蒸馏水(ml)1.00.90.80.70.60.40.2G-250试剂(ml)各4蛋白质含量（μg）01020304060802．样品中蛋白质含量的测定：（1）准确称取约200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定容至刻度。（2）另取2支具塞试管，准确加入0.5ml样品提取液，再加入0.5ml蒸馏水，4ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））3．结果处理：六、注意事项：比色出现蓝色应在2min～lh内完成。（蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。）1．考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin—酚试剂法（Lowry法）2．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。）3．如何正确使用分光光度计？七、思考题：八、实验报告：按常规。分光光度计的使用与注意事项1.接好电源线。2.启动电源开关，仪器显示“F7230”，预热20分钟（要打开比色皿盒盖）。3.（1）设置年、月、日、时、分：按“CLEAR”键，仪器显示“YEA”进入年份设置，按数字键，输入对应的年份（限输两位数，下同），再按“MODE”输入成功（下同）；显示“MON”表示进入月份设置；显示“DA”表示进入日期设置；显示“HOU”表示进入小时设置；显示“MIN”表示进入分钟设置。最终仪器显示当时的时间。3.（2）不设置年、月、日、时、分：按“CLEAR”键，仪器显示“YEA”，直接按“0%t”键，仪器显示“00-00”，表示仪器进入计时状态，时间从88年1月1日0时0分开始。4.按“MODE”键，仪器显示“T”，即可进入测定。5.调节波长旋纽使波长移到所需之处。6.四个比色皿，其中一个放入参比试样（装量要合适），其余三个放入待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧盖上样品池盖。7.将参比式样推入光路（注意听‘咔嚓’声），按“100%t”键，至显示“T100.0”（调100）。8.打开样品池盖，按“0%t”键，仪器显示“T0.0”（调零）。9.盖上样品池盖，按“100%t”键，至显示“T100.0”（调100）。10.然后将待测试样推入光路，显示试样的“T”值（测定）。11.如需测定“A”或“C”，则“MODE”键转换即可。12.如果要想将待测试样的数据记录下来，只要按“PRINT”键即可（打印）。