根癌农杆菌介导法

植物基因工程——根癌农杆菌介导法——农杆菌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。——原理根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,改造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。——Ti质粒结构特点转移到植物基因组中的DNA序列，与肿瘤形相关。激活T-DNA的转移，使植物致瘤，是毒性区。调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移，是接合转移编码区。调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区。Ti-质粒的基因结构T-DNA区（transferredDNAregion)Vir区（virulenceregion)Con区（regionencodingconjugation)Ori区（originofreplication)——Ti质粒的改造策略由于野生Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质粒可以采取两种不同的改造策略——一元载体系统和二元载体系统。相较而言，二元载体更多优点：1、构建方便；2、效率高；3、不会带人大量无用的冗余DNA序列。——一元载体（卸甲载体）1.切除T-DNA中的致瘤基因，仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。2.在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中间载体同源的质粒序列。3.用特定转移方法转移中间载体，发生同源重组。4.根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。5.用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。——二元载体基本原理：T-DNA区与Vir区不在同一个载体上，Vir区通过反式作用使T-DNA区发生转移。微型Ti质粒根癌农杆菌辅助Ti质粒外源基因微型Ti质粒含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌植物缺失Vir，T-DNA卸甲，引入酶切位点去掉T-DNA去——T-DNA导入植物基因组的过程一、农杆菌对受体的识别菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋向性。二、农杆菌附着到受体细胞创伤部位生存了8~16h（细胞调节期）的菌株才能诱发肿瘤。期间，农杆菌产生纤丝将自身缚附在植物细胞壁表面。三、诱导和启动毒性区基因表达把植物受伤细胞提取液加入培养基，Vir区基因均被诱导和活化。Vir接收信号VirA编码受体蛋白（受体蛋白与化学信号分子结合）C端活化（具激酶功能，使组氨酸残基磷酸化）VirA蛋白被激活（转移其磷酸基团至Vir蛋白)Vir族蛋白活化四、类似接合孔复合体的合成和装配五、T-DNA的加工和转运六、T-DNA的整合——影响T-DNA转移的因素农杆菌菌株菌株侵染力：农杆碱型菌株胭脂碱型菌株章鱼碱型菌株农杆菌菌株高侵染活力的生长时期一般用0.3~1.0OD农杆菌菌液接种植物材料基因活化的诱导物常用诱导物：乙酰丁香酮（AS）、羟基乙酰丁香酮（HO-AS)外植体的类型和生理状态发育早期的组织细胞具有很强的分裂能力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加速分裂，处于转化的敏感期。外植体的预培养一般为2~3天作用：促进细胞分裂；使外植体适应于试管立体培养的条件；有利于外植体能与培养基平整接触。外植体的接种及培养一般接种时间1~30min接种菌液浓度0.3~1.5OD——基因枪法Vs农杆菌法转化效率宿主范围操作可控度基因枪法低无限制简便高根癌农杆菌介导法高单子叶植物；一些双子叶植物复杂低