密度梯度离心

实验五植物细胞液泡系与细胞骨架的染色与观察实验四叶绿体的分离与观察实验四叶绿体的分离与观察9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles(细胞器)Centrifugationcanseparatemanytypesofoganellesfromcellhomogenate.9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles(细胞器)CentrifugationcanseparatemanytypesofoganellesfromcellhomogenateFractionation(细胞组分的分级分离).Centrifugationtechniques:(1)Differentialcentrifugation(差速离心)(2)Density-gradientcentrifugation(密度梯度离心)9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles(细胞器)Centrifugationcanseparatemanytypesofoganellesfromcellhomogenate,1stStep:Differentialcentrifugation沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。Pellet(颗粒团)Supernatant(上清液)常用介质(高溶解性的惰性物质):氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles(细胞器)Centrifugationcanseparatemanytypesofoganellesfromcellhomogenate,2ndStep:Density-gradientcentrifugation实验四叶绿体的分离与观察一、实验原理1、密度梯度离心•当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。•两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。2、叶绿体荧光•叶绿体受激发光照射后可直接发出红色荧光，称为自发荧光（或直接荧光）。•叶绿体吸附荧光染料吖啶橙后可发出橘红色荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光）。二、试剂与器材•器材普通离心机，组织捣碎机，电子天平，烧杯，量筒，移液枪，1.5mL离心管，试管架，纱布，无荧光载玻片和盖玻片，普通光学显微镜，荧光显微镜。•试剂预冷的匀浆介质（0.05mol/LTris-Hcl缓冲液，pH=7.4；0.25mol/L蔗糖），50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.1%吖啶橙。•材料新鲜菠菜三、实验流程3min4层纱布过滤于烧杯中8000r/min20min制片镜检菠菜叶，洗净去叶梗和主脉匀浆介质50%蔗糖溶液0.4mL15%蔗糖溶液0.4mL0.6mL10uL1、新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于100mL匀浆介质中，放入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机匀浆3min。3、将匀浆用4层纱布过滤于烧杯中(滤掉大组织碎块）。4、在1.5mL离心管内依次缓慢加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液各0.4mL。5、沿离心管壁小心缓慢地加入0.6mL叶绿体匀浆。6、离心：8000r/min，20min；叶绿体在密度梯度液中间形成带。7、取叶绿体悬液1滴（10～15uL）滴于载玻片上，加盖玻片后观察。观察一：在普通显微镜下观察叶绿体形态（油镜）；观察二：在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光（蓝光）。8、取一滴悬液在载玻片上，加1滴0.1%吖啶橙荧光染料，加盖玻片。观察三：在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光（蓝光）。实验步骤今天的任务观察一：普通显微镜，叶绿体形态（油镜）。观察二：荧光显微镜，直接荧光（蓝光）。观察三：荧光显微镜，间接荧光（蓝光）。染色方法：先滴1滴叶绿体悬液于玻片上，然后加一滴吖啶橙荧光染料。注意事项•叶绿体分离提取每张实验桌为1组进行称量、匀浆和过滤。每人取0.6mL过滤液进行密度梯度离心。•显微镜观察B413先制片观察结构，然后再染色观察荧光；B415先制片染色观察荧光，然后再观察结构。•离心机的使用同组所有同学到齐后开始离心。•密度梯度制作密度梯度时，沿管壁小心注入上层溶液，保持两种溶液界面完好。•制片要盖盖玻片，吸干多余的液体。习题1．描绘叶绿体的形态结构。2．简述密度梯度离心的原理。