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凯普技术支持中心2013.04凯普HPV产品操作培训技术原理：基因扩增导流杂交低密度基因芯片分型：15种高危型别：HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68.6种低危型别：HPV6,11,42,43,44,CP8304（81）.21分型宫颈脱落细胞用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞男性尿道标本用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。男女性疣体标本既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。适用样本及采集方法①细胞学检测采集的样本中，凯普可以使用TCT检测所剩余的保存液来检测，但需要根据所剩细胞的浓度适当增加取样量至1~2ml。②如果必须使用同类产品保存液保存的样本，亚能与港龙的保存系统我司可以提取使用，HC-II的保存系统要确保未进行处理过才可使用。样本采集前注意事项A不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。（可能会抑制PCR反应）B检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等等阴道内用药物。（（可能会抑制PCR反应）C检查前48小时不应有性生活。D月经期不可采集标本。（防止血液过多）E注意避免交叉污染。先采集HPV检测样本，再采集TCT或LCT、病理组织样本样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4℃存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。一周后检测的标本应保存在-20℃。样本采集前注意事项取800μl临床样本，加入离心管中14000rpm离心3分钟，去上清加入400μl溶液Ⅰ，混匀100℃裂解15分钟加入400μl溶液Ⅱ，混匀，放置5分钟14000rpm离心5分钟，去上清14000rpm离心1分钟，再次去上清加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，-20℃保存对于无明显肉眼可见组织刷取物时，可适当加大实验样本量，或多次收集样本。取样前振荡混匀。溶液Ⅰ用于裂解细胞，释放DNA。金属浴应防止爆盖发生，可压重物，15分钟后，待金属浴温度降至80℃以下再取出离心管；水浴应用螺旋盖离心管，旋紧，同时应防止进水。裂解后应点动离心再加入溶液Ⅱ溶液Ⅱ用于溶解脂类、蛋白质等杂质，沉淀DNA。溶液Ⅱ放入冰箱预冷可提高DNA的沉降效率该步意在充分去除溶液Ⅱ，因溶液Ⅱ为有机溶剂，会影响Taq酶的活性，抑制PCR扩增，导致IC点浅或者不出的情况。溶液Ⅲ用于溶解DNA。点样上机前，应进行离心，14000rpm，1分钟。以沉淀细胞碎片等物质，防止扩增受到抑制。超净工作台离心机标本制备区旋涡混合器微量移液器金属加热器离心机样本制备所需仪器提取操作注意事项提取操作注意事项临床样本中有效细胞量太少：取500ul临床样本离心后，管底基本上看不到或者看到很少沉淀的时候，把第一次离心后的上清小心去掉，再加入500ul临床样本进行第二次离心，收集两次沉淀细胞。临床样本中血液太多：有些临床样本中由于种种原因，含有太多的血液。处理方法为取500ul临床样本离心后，去除上清，然后加入蒸馏水洗涤两次，或样本离心后用枪吸去沉淀的血细胞临床样本中黏液太多：1，建议医生按正确的方法取样。2，再加入500ul的临床样本，震荡混匀后，用1ml枪头洗出部分溶液，离心后按照正常的操作程序进行。如果离心后沉淀比较少，可以重复一次。3，将刷子连带粘在其上的粘液取出男性样本或女性疣体样本提取方法（棉拭子样本）提取操作注意事项采集管内加500ul生理盐水，充分振荡↓溶液倒入提取管中，14000rpm离5min↓收集细胞↓下同宫颈分泌物标本操作采集管内加500ul溶液Ⅰ，充分振荡↓转移出400ul溶液至提取管中100℃加热15分钟↓下同宫颈分泌物标本操作方法一方法二因方法二会因细胞太少而出现假阴性的情况，故建议用方法一操作石蜡包埋组织样本提取方法提取操作注意事项WAYONE（1）称取0.01-0.05克石蜡标本，放入到1.5ml的微量离心管中。（2）加入1ml的二甲苯，室温下孵育10分钟除蜡，倒掉二甲苯。（3）加入1ml100%无水乙醇，孵育10分钟，倒掉无水乙醇。（4）加入1ml95%1乙醇，孵育10分钟，倒掉。（5）加入1ml75%乙醇，孵育10分钟，倒掉。（6）室温下让乙醇挥发完全。（7）组织重新悬浮在400µl溶液Ⅰ和1µl50mg/ml蛋白酶K，震荡混匀。（8）样品56°C孵育3小时。(9)沸水中煮沸15分钟。(10)冷却,然后加入400µl溶液Ⅱ,充分混匀，室温下放置2分钟。(11)14000rpm离心5分钟。(12)去干净上清(13)加入60µl溶液Ⅲ,充分溶解。取1µl作为PCR模板进行扩增或储存在-20℃。新鲜组织样本提取方法（1）称取0.01-0.05克新鲜组织，研磨后加入细胞保存液形成悬液。若无法研磨可将组织剪碎并适当延长裂解时间。若有蛋白酶K，则在56℃下裂解直至消化完全，若无蛋白酶K则在100℃下裂解直至消化完全。（2）以下与常规提取相同。匹基、达安等都是使用直接煮沸法提取的DNA，这样的DNA纯度较差，对于凯普HPV检测中的PCR扩增过程会产生抑制，所以不能使用。使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA，可以保证其DNA的纯度及浓度，可以使用。提取DNA质量要求PCR试剂的制备PCRMIX（μl）Taq酶（μl）DNA模板（μl）1人份量23.250.75110人份量232.57.51020人份量465152030人份量697.522.5301PCR试剂存放在-20℃中避光保存，避免反复冻融试剂。2配制时严格按说明书上的比例和量进行混合分装。3试剂准备区中进行，充分解冻试剂并且点动离心后，方可吸取混匀4酶与PCRmix要充分混匀。5分装和加样时，不可使用有粉橡胶手套，一般仅能佩戴薄膜手套。6PCR小管及其他实验耗材不可长时间置于紫外灯下照射，否则会抑制PCR扩增。7有条件的客户，要对离心管、移液器吸嘴进行高压灭菌，包装完整的PCR小管可直接使用。8注意对移液器的保养，移液器使用后应及时调回最大量程，并定期进行校准，防止量程偏大或者偏小。9加样时，尽量做到加完一个样，立即关盖，再加下一个样。加样完毕后，点动离心，清除气泡。PCR试剂的制备扩增区PCR仪的质量要求最好选用进口PCR仪PCR仪的扩增速率不能太高，扩增仪的扩增速率最好保证1℃/s没有热盖的PCR仪要注意加样后再加一滴矿物油仪器运行的房间一定要打开空调①蠕动泵损坏启动蠕动泵后听不到蠕动泵运转的声音，请送修。②排液管粘连这种情况一般出现在新仪器第一次使用或仪器闲置太久后第一次使用。当启动蠕动泵后听到仪器内部有类似“啪啪”的声音，可判断是排液管粘连。解决方法是：在反应室内注入水，然后启动蠕动泵直到排水即可。③排液管堵塞主要是实验后清洗不彻底，或使用时间较久后，实验液体中的化学物质残留于排液管内形成结晶物，堵塞了排液管导致不能排液，其现象特征是启动蠕动泵后，有蠕动泵正常运转的声音，但没有液体排出。解决方法：在反应室内加蒸馏水,升温至65℃并保持几分钟,使结晶物溶化,然后排液。反复几次使排水管畅通。如若仍不能排液则需要拆出排液管来清洗或更换排液管。杂交前配件安装问题解决方法④密封不良A配件组装不良多孔板及分隔膜、硅胶圈没有放好，形成空隙，造成整个系统不密封,建议重新放置。B多孔板问题多孔板因跌落或其他原因造成变形，也会造成密封不良。另外由于多孔板加工精度的限制，多孔板的厚度并不完全均匀，在放入反应室时，放置的面或方向不同都会造成排液速度的变化，有时甚至会引起排液慢的现象，如果是这种情况可把多孔板翻转一下。C硅胶圈问题硅胶圈的老化，弹性不足，也是造成密封不良的原因之一，同时也会引起互渗。硅胶圈平时使用后应存放在阴凉干净的地方，防止紫外线照射，定期更换硅胶圈。杂交前配件安装问题解决方法外壳用软布沾清水或稀释的中性清洗剂拧干后擦拭，勿用酒精或其它有机溶剂清洁显示屏部分。反应室、分隔室、多孔板、硅胶圈用软刷子刷洗3次，再用纸吸干表面的水珠，自然晾干。分隔膜、硅胶圈冲洗即可，不要揉搓，用纸吸干表面的水珠，自然晾干。不可照紫外，不可浸泡次氯酸钠溶液。外置电源表面的灰尘用干布擦拭干净即可，注意检查接线柱是否拧紧。杂交仪的维护水浴锅HybirMax®医用核酸分子快速杂交仪扩增产物分析区（杂交区）微量移液器杂交间所需仪器杂交操作注意事项杂交操作注意事项酶标液与封阻液的瓶子规格及颜色一致（标签颜色不同），加液前应确认后再加液。溶液I与溶液II亦如此。第一个孔与最后一个孔之间存在着加液时间差，第一个孔比最后一个孔的杂交时间要长2～3min。所以在加酶标液及显色液时，顺序应由最后一个孔往第一个孔加。减少膜整体之间的背景及点深浅差异。加热变性后应保持仪器仍在运行状态下迅速转移出PCR产物放入冰水浴中①互渗互渗的测定方法参见技术巡访指引，若在杂交实验前发现有互渗现象需立即停止后续实验，重新安装分隔硅胶圈、分隔室及压扣盖，再进行互渗现象试验，如果仍然有此现象出现，则即使联系厂家更换硅胶圈。②反渗、下渗A：确保分隔膜、硅胶圈、分隔室及压扣盖安装正确。B：开泵抽液不要抽的太干，太快。待液体快排完时采用点动排液。③漏液在杂交前发现漏液的话需重新安装配件。在杂交过程中要时时查看反应室的液体情况，若有漏液现象再加适量的杂交液即可。杂交实时问题解决方法1）最佳：每次实验做阴阳性对照各一（符合PCR实验室考评标准）2）其二：每个批号做阴阳对照各一。3）其三：每周、每月或者每季度，做阴阳对照各一。4）大多临床：不做阴阳对照（最节省医院成本）。建议医院做对照，但由检验科主任、PCR室负责人依据自身情况要求决定对照实验频率。阴阳性对照设置问题结果判读阴性结果阳性结果多重感染导流杂交原理结果常见问题分析可能原因：1、PCR产物变性后部分复性；2、DNA样本中有对PCR反应的抑制物质，影响了PCR扩增的效率。1、弱/无信号或IC点不清楚，同时阳性点也不清楚或者比较淡2、IC及HPV分型阳性点不显色（只有生物素点）可能原因：①可能存在PCR抑制剂，建议重新提取，如无原始标本，可用1：10稀释DNA模板重复PCR过程；②PCR产物变性后复性，可重新PCR扩增，然后再杂交分析。3、IC点弱/不显色，但HPV分型阳性点显色可能原因：①IC和HPVDNA之间存在竞争，高浓度的HPVDNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制，此现象出现时如HPV分型点显色正常，则分型结果正确；②可能杂交仪温度轻微偏低，IC点的探针Tm值比各型别探针高。结果常见问题分析①PCR试剂可能被污染，取10l以上PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；②阴性对照模板被污染，对照实验验证；③实验过程操作污染，建议操作环境及所用移液枪消毒灭菌处理。5、阴性对照显现HPV分型阳性点6、很高的背景①可能由于封闭不足，使未结合的酶残留在膜上，请确保封阻液完全覆盖整个杂交膜；②可能因为没有完全将未结合的试剂清洗干净，请确保在显色过程中杂交膜充分清洗，无剩余残留液体；③显色时间过长，显色时间为3-5min，但可根据显色程度来终止显色反应。4、Biotin点不显色①请确认所使用试剂是否仍在有效期内。②确定实验操作是否严格按照说明书进行、试剂是否按要求保存使用。可判读的弱阳性可能扩增效率低，导致各点显色较浅；样本的DNA浓度较低；PCR产物变性后复性等。IC点及阳性点都很弱多重感染在多重感染中，不同型别之间可能会存在竞争性抑制，导致个别型别被抑制，排除污染的情况下，弱阳性点都要报结果。污染的防治100℃加热过程中爆盖如使用金属浴加热，可压重物以防爆盖；水浴加热，采用螺旋盖的离心管，旋紧；确保所用离心管的质量合格手套污染标本采集管未旋紧，震荡中漏液，造成手套污染；倒液时，手套污染。应及时更换手套加试剂或加样等操作中飞沫飞溅小心操作，加一个样盖一个样移液器与样本管相接触，造成样本与样本及样本与试剂间的交