第13章基因重组和基因工程

基因工程与基因体外表达GeneticEngineeringandgeneexpressioninvitro第13章重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子1997年,动物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验2001年，人类基因组计划一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达第一节基因克隆是利用工具酶进行操作关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGII型限制性核酸内切酶：能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ5’…G▼AATTC...3’HindⅢ5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ5’…C▼CGG...3’MboⅠ5’…▼GATC...3’NdeⅠ5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ5’…GG▼CC...3’PvuⅡ5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ5’…CCC▼GGG...3’限制性内切核酸酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第二节基因克隆需要特定的载体基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ替换型载体（取代型载体）•外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~20kb)•高感染效率(109转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍)e.g.EMBL3,DASH凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb3.粘性质粒(cosmid):适合克隆大的DNA片段柯斯质粒载体的特点1.具有λ噬菌体的特性；2.具有质粒载体的特性；3.具有较高容量的克隆能力；4.具有与同源性序列的质粒进行重组的能力柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。4.病毒载体病毒载体优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；2、复杂的装配过程由细胞完成；3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题：1、安全性2、靶向性3、有效性细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶向性转录靶向性转导效率靶向性基因表达水平和持续时间表达的可调控性病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体单链RNA病毒8~10kb可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；Exvivo基因治疗；肿瘤基因治疗。腺病毒载体双链DNA病毒36kb可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；Invivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。AAV病毒载体单链DNA病毒~5kb可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；Invivo基因治疗；Exvivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。HSV病毒载体双链DNA病毒152kb具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。常用的病毒载体的特点：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）5.其他表达载体指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。原核表达载体在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表达元件。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有：Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的双启动子)、λPL(λ噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。真核表达载体至少要含两类序列：①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。选用质粒（最常用）做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr。第三节基因克隆的过程1、制备目的基因和相关载体2、将目的基因和有关载体进行连接3、将重组本DNA导入受体细胞4、DNA重组体的筛选和鉴定5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线以质粒为载体的DNA克隆过程1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.