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一、植物组织培养的概念1.概念植物组织培养（Planttissueculture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养：对幼苗和较大植株等的培养。（2）胚胎培养：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。（3）器官培养：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花的培养。（4）组织培养：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。（5）细胞培养：对单细胞或较小的细胞团进行培养。（6）原生质体培养：对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养矮牵牛茎尖离体培养培养人参细胞悬浮培养三、植物组织培养技术的理论基础植物细胞的全能性(Plantcellulartotipotency）从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、组织和细胞的不同而异。§1实验室设置及仪器设备§2实验基本操作§3培养基的成分及其配制§4培养条件的选择§1实验室设置及仪器设备实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。1．基本实验室1.1洗涤根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。配备的主要仪器设备有：天平、微波炉、pH计、药品柜、器械柜、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶、冰箱等。冰箱用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。1.2配制培养基?配备高压灭菌锅、排风灭火设备等。如果没有条件的话，可以将上述工作合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。1.3消毒无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。1.4无菌操作室？为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。1.5培养室为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2、温室（一）、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）灭菌§2实验基本操作1、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）、紫外灯、超声波等。2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等（二）、灭菌的方法干热灭菌玻璃器皿、器械湿热灭菌培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌接种室、培养室过滤灭菌液体培养基、蒸馏水药剂灭菌培养材料烧灼灭菌器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌接种室、培养间各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃、90～120min（1）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20～30min注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖（2）湿热灭菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。（3）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。（4）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。（5）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min)效果残液去除难易乙醇70-750.1-3好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mgl-130～60较好较难次氯酸钙/纳9～105～30好易（6）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿：洗→热压玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→泡75%~95%酒精→烧培养基：湿热培养材料外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理内部细菌茎尖培养加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸污染来源三、无菌操作技术1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正确错误接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中正确错误用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。四、外植体的选择与处理技术1、选择优良的基因型试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。2、取材从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。（一）、外植体的选择§3.培养基的成分及其配制一、培养基的成分及其作用（一）无机营养物质培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。•培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供大量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。微量元素（二）.有机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物1、维生素类物质维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。2、AA类物质绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解