第14章基因重组和基因工程--本科

目录基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第14章目录第二节重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone目录重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录148天目录克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。原是英文clone的音译，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。目录一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。（）获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆目录技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。细胞克隆：由单一的共同祖先细胞分裂形成的细胞群体。个体克隆（动物或植物）：基因完全相同的两个或更多的个体组成的群体。目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆（）目录DNA克隆各种来源DNA＋载体DNA复制子(replicon)酶学方法宿主细胞转染转化转化子细胞筛选扩增提取获得大量同一DNA分子目录生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（）目录（二）工具酶限制性核酸内切酶Klenow片段：DNA聚合酶Ⅰ大片段逆转录酶DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：（）目录此酶存在于细菌体内，与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录双链DNA中含有两个结构相同、方向相反的序列，称为反向重复序列，也叫回文结构。即每条单链以任一方向阅读时与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构（）目录BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口（切割点是识别序列的对称轴）粘端切口切口：平端切口、粘端切口5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端目录3’突出粘性末端GATCCG+•5’突出粘性末端GATCCG+GCCTAG5’GCCTAG3’目录来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ5’…G▼AATTC...3’HindⅢ5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ5’…C▼CGG...3’MboⅠ5’…▼GATC...3’NdeⅠ5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ5’…GG▼CC...3’PvuⅡ5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ5’…CCC▼GGG...3’限制性内切核酸酶目录（三）目的基因(targetgene)（）cDNA(complementaryDNA)指经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA(genomicDNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。目录（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体（）质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。目录载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。目录克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。目录1.质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。概念：是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，大小为1-200kb。耐四环素基因耐氨苄青霉素基因目录λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列线性双链DNA分子，大小约50kb。目录酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)柯斯质粒载体(cosmidvector)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）3.其他目录以质粒为载体的DNA克隆过程目录二、重组DNA技术基本原理（）目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达目录（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)(见第22章)目录已知目的基因的核苷酸序列已知基因产物的氨基酸序列。化学合成法推导出编码基因核苷酸序列化学合成仪合成目的基因一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、干扰素基因等。目录化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库目录以mRNA为模版，反转录合成cDNA，与载体拼接后导入受体菌，即获得cDNA文库。由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的基因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是如此分离的。从cDNA文库获取目的基因mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT目录（二）克隆载体的选择和构建外源DNA片断离开染色体是不能复制的，必须借助载体，随载体的复制而复制，重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。目录（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接即DNA的体外重组，靠DNA连接酶将外源基因与载体共价连接，其连接方式主要有：1）同一限制酶切位点连接2）配伍末端连接2、平端连接：非配伍粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3、同聚物加尾连接在末端转移酶作用下，在DNA片断末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，而后进行粘性末端接。4、人工接头连接对平端DNA片断或载体DNA可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的酶切位点，再用识别新位点的限制酶切割，产生粘性末端，这也是粘性末端连接的一种特殊形式。目录（四）重组DNA导入受体菌外源DNA(含目的DNA)与载体在体外连接成重组DNA分子后，需将其导入受体细胞(形成转化子)。随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。目录受体菌条件：1）容易接纳重组分子2）对载体的复制扩增无严格要求3）不存在特异的限制-修饰酶体系降解或修饰外源DNA4）符合“重组DNA操作规则”的安全标准。目录1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Souther