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第六章阳性重组子的筛选和鉴定（检）由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。•转化子•重组子•目的重组子阳性重组子的筛选和鉴定（检）一、根据遗传表型筛选二、应用限制性内切酶酶切分析筛选三、核酸探针筛选四、PCR筛选五、菌落原位杂交技术不同检测方法可以归类于以下三个层次：1.载体遗传标记检测2.克隆DNA序列检测3.外源基因表达产物检测一、根据遗传表型筛选1．抗生素平板筛选2．互补筛选3．插入表达筛选4．噬菌斑筛选1．抗生素平板筛选大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含有两个抗药性基因的载体中，通过插入失活其中一个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗药性，插入失活Tetr后，Tetr、Ampr为含载体的阴性菌落，Tet-、Ampr表型的菌落为阳性，Tet-、Amp-的表型不能生长，对未转化的受体细胞，该方法筛选出阳性重组子的几率较高(Tetr：四环素抗性；Ampr：氨苄毒霉素抗性，Tet-：对四环素敏感；Amp-：对氨苄青霉素敏感)Ampicillinresistant?yesyesTetracyclineresistant?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroripBR322AmprTcroriScreeningbyinsertionalinactivationofaresistancegeneReplicaplating:transferofthecoloniesfromoneplatetoanotherusingabsorbentpadorVelvet(绒布).transferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracyclinethesecolonieshavebacteriawithrecombinantplasmid2．互补筛选利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒常采用互补筛选。-半乳糖苷酶(-galactosidase)是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的-半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子，它们使载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码-半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基--D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺陷型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程称-互补。因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱导物IPTG存在下，细菌在含生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时，可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。蓝白筛选3．插入表达筛选有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因上游存在CI基因的负调控序列，CI基因可以抑制Tetr基因的表达，当外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglI位点时，Tetr基因阻碍解除而表达，阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet-表型，故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。4．噬菌斑筛选对于以λ噬菌体载体系统，外源DNA插入λ噬菌体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型λDNA长度的78％～105％范围内，才能在体外包装成具有感染活力的噬菌体颗粒，感染细菌后，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA片段插入的载体不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细胞并形成噬菌斑，从而达到初步筛选的作用。二、应用限制性内切酶酶切分析筛选对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。三、核酸探针筛选为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切酶消化重组子凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。四、PCR筛选PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳，可直接观察到产物的存在。一些载体的外源DNA插入位点两侧，存在恒定的序列，通过与插入片段两侧的SP6及T7启动子互补的引物，对小量抽提的质粒DNA进行PCR分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。对于原核或真核系统表达型重组子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，故有必要对重组子进行序列测定。也可利用已知的外源DNA的核酸序列，设计特异的引物直接用PCR进行扩增，并检测产物。五、菌落原位杂交技术迄今最为通用的筛选重组子技术仍为菌落或噬菌斑原位杂交技术，它是先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移至另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。本方法能进行大规模操作，一次可筛选5×105～5×106个菌落或噬菌斑，对于从基因文库中挑选目的重组子，是一项首选的方法。