第20章重组DNA技术

第二十章重组DNA技术recombinantDNAtechnique第一节重组DNA技术的基本过程重组DNA技术：又称DNA克隆或基因克隆应用酶学的方法，在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。重组DNA(recombinantDNA,或嵌合DNA,chimeraDNA)：采用克隆技术，把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。重组DNA技术的基本过程第二节重组DNA技术中常用工具酶一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶四、其它修饰酶1.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)—基因工程的手术刀功能：识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生黏性末端或平末端。根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG作用模式图：（1）产生5突出黏性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′POH—作用模式图：（2）产生3突出黏性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********作用模式图：（3）产生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′OH——PCT*************GA*************同裂酶来源不同但能识别相同序列的酶，又称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端，称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA可变酶识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。此类酶是Ⅱ型限制酶的特例。如：BstpⅠGGTNACC;BblⅠGCC(N)4NGGC2.DNA连接酶(DNAligase)—基因工程的缝纫针将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。功能：催化两条双链DNA分子的互补黏性末端或平末端的5磷酸基团与3羟基形成磷酸酯键。也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。DNA连接酶催化平末端连接要比黏性末端效率低得多。DNA连接酶有T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶DNA连接酶EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—POH—DNA连接酶作用模式图：（1）连接黏性末端作用模式图：（2）连接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′OH——PCT*************GA*************DNA连接酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合作用类型：大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段TaqDNA聚合酶反转录酶三、DNA聚合酶四、其它修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）功能：催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是单链DNA或有3′突出末端的双链DNA。OH5′3′Mg2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A、G、C、T)n末端转移酶(2)底物是平端或3′凹端的双链DNA。5′3′Co2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi5′3′Co2+dNTPnppi5′3′OHOH(A、G、C、T)n用途：（1）主要作用是在载体或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。（2）DNA3′末端的同位素标记。重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。载体（vector）指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具第三节重组DNA技术中常用载体作为基因工程载体所需具备的基本条件能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA；拷贝数高具有较高的遗传稳定性克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。质粒载体：最常用的对目的基因克隆噬菌体：主要用于构建基因组DNA或cDNA文库M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA测序粘粒：用于克隆大片段DNA酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物毒，用于在真核细胞中表达目的蛋白基因工程载体的种类和用途1.质粒(plasmid)载体细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构与功能：Ampr,Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因分子量较小拷贝数较高pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSMCS：MultipleClonningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆2.噬菌体(phage)载体噬菌体(phage)M13噬菌体粘粒(cosmid)3.人工染色体载体YAC可接受100kb～2000kb的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体包含的调控元件：着丝粒、端粒、复制起始点、限制性酶切位点、选择标记、原核序列及调控元件4.病毒载体目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类反转录病毒载体（整合型）腺病毒载体（游离型）第四节目的基因的获得和体外重组一、目的基因的获得----分二、目的基因的体外重组----切、接目的基因(targetDNA)cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)目的:分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）种类：（一）化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列（二）聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（三）从基因文库中筛选（一）目的基因的获取—分*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因反转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT基因组文库：G-文库cDNA文库：c-文库(常用)方法：基因文库用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。（三）外源基因与载体的连接—接1.黏性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点G