PCR技术的原理与方法

PCR技术的原理与方法钟召迪PCR定义聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。是指在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，一特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母链模板DNA互补的子链DNA的过程。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等。PCR反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低PCR技术的基本原理PCR的反应成分PCR的反应基本步骤PCR的反应体系PCR的反应成分模板DNA引物四种脱氧核糖核苷酸DNA聚合酶反应缓冲液，Mg2PCR的反应基本步骤PCR的反应基本步骤变性：高温使双链DNA解离成单链（94℃，30s）退火：低温下，引物与DNA模板互补区结合（55℃，30s）延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应（70~72℃，30~60s）PCR的反应体系10×扩增缓冲液1/10体积4种dNTP混合物各200umol/L引物(2个)0.2umol/L模板DNA102～105TaqDNA聚合酶1～2.5单位/反应体系Mg2+1.5～2.5mmol/L加双或三蒸水至25～50ulPCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则引物最好在模板cDNA的保守区内设计引物长度一般在15~30碱基之间引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃引物3′端要避开密码子的第3位引物3′端不能选择A，最好选择T碱基要随机分布引物自身及引物之间不应存在互补序列引物设计的原则引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰扩增产物的单链不能形成二级结构引物应具有特异性酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少DNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低模板（靶基因，TARGETGENE）模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸MG2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少PCR反应条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想延伸温度与时间延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多谢谢！