实验六-虎杖中大黄素的提取、分离和检识

实验六虎杖中大黄素的提取、分离和检识虎杖又名阴阳莲、土地榆、苦杖，为蓼科植物虎杖（PolygonumcuspidatumsiebetZucc．）的根茎。有活血化瘀，清热解毒，祛痰止咳等功用。近年来用于治疗急性黄疸，降低血脂，升高白血球和血小板，并可治疗慢性气管炎等多种炎症及烧伤等症。虎杖根茎中含有大量的蒽醌成份和二苯乙烯类成份。一、虎杖根茎中已知主要成份的理化性质1．大黄酚（Chrysophanol）：金黄色片状结晶（丙酮）或针状结晶（乙醇），mp196~197℃，能升华。可溶于苯、氯仿、乙酸、乙醇。NaOH水溶液及热的Na2CO3水溶液。微溶于石油醚和乙醚，不溶于水，NaHCO3和Na2CO3水溶液。2．大黄素（Emodin）：橙黄色针状结晶，mp256~257℃，能升华。易溶于乙醇，可溶于NH4OH、Na2CO3和NaOH水溶液，几乎不溶于水。3．大黄素甲醚（Physion）：砖红色针状结晶，mp206℃，能升华。易溶于NaOH溶液，可溶于苯、氯仿、吡啶、甲苯，微溶于乙酸、乙酸乙酯、乙醚，不溶于水。4．大黄素葡萄糖苷（Emodinmonoglucoside）：浅黄色针状结晶（稀乙醇中析出，含分子结晶水），mpl90~191℃。5．白藜芦醇（Resveratol）：无色针状结晶，mp256~257℃，216℃，264℃，能升华。易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等。6．虎杖苷（白藜芦醇葡萄糖苷，Polydatin，Piceid）：无色针状簇晶，mp223~226℃（分解）。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、热水，可溶于乙酸乙酯，Na2CO3和NaOH的水溶液，微溶于冷水，难溶于乙醚。16二、目的要求1．掌握从虎杖中提取羟基蒽醌类成份的方法。2．熟悉用硅胶柱层析方法分离混合羟基蒽醌类成份的一般操作技术。3．熟悉羟基蒽醌类化合物的主要检识反应。三、实验原理本实验是根据游离蒽醌类成份能溶于含水氯仿的性质，先将原料的浓酸溶液湿润后，加入含水氯仿进行回流提取，在回流过程中即可将结合态的蒽醌（苷类）类成份水解成为游离蒽醌，这样就可连同原存在的游离态蒽醌成份，一并被含水氯仿提取出来。也可根据虎杖中的蒽醌类成份能溶于乙醇的性质，采用乙醇提取，又利用游离蒽醌类可溶于热的含水氯仿的性质，将乙醇提取物以含水氯仿热回流，使游离蒽醌与蒽醌苷及其它极性较大的醇溶性杂质分离。羟基蒽醌类化合物可以利用化合物酸碱强弱不同进行分离。其羧基或多个β－位酚羟基的可溶于碳酸氢钠溶液，具有一个β-位酚羟基的可溶于碳酸钠溶液，故可以用PH梯度法进行分离，另外，也可根据化合物极性大小不同用硅胶柱层析法进行分离。大黄素的极性比大黄素甲醚大，在吸附层析中吸附较牢，因此在大黄素甲醚之后洗脱下来。四、实验材料虎杖粗粉、含水氯仿（水饱和）、苯、乙醇、柱层析用硅胶（100~160目）、硅胶-CMC硬板、苯∶乙酸乙酯（82∶）、乙醚、碳酸钠、氢氧化钠溶液、盐酸、点滴板、1000cc圆底烧瓶、蒸发皿、层析柱、试管、梨形分液漏斗、精制棉、循环水泵、旋转蒸发器、电热套、水浴锅。五、实验内容（一）游离蒽醌的提取方法一：称取虎杖粗粉50g，加10%硫酸溶液50ml，充分搅拌混刀，加氯仿200ml，热水浴上回流提取1小时，过滤得氯仿滤液。药渣继用氯仿200ml回流1小时，过滤，合并两次氯仿提取液于圆底烧瓶中，加沸石数粒，水浴上蒸馏回收氯仿至干（可减压抽干氯仿），得红棕色残留物。再加苯30ml于圆底烧瓶中水浴上回流半小时，过滤得苯滤液置于蒸发皿中，加柱层析用硅胶粉3~5g，搅拌均刀后于通风处晾干，得均刀样品粉末，供作柱层析分离用。方法二：取虎杖粗粉50g，加95%乙醇500ml加热回流1小时，倾出液体，再加400ml乙醇回流半小时，合并两次提取液，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加入含水氯仿100ml加热回流提取1小时，倾出氯仿，如果氯仿提取液色深，则再提取1次，提取液合并，用水50ml分2~3次在分液漏斗中洗涤，洗后回收氯仿至剩约10ml，趁热倾入一小锥形瓶中，放置析晶，抽滤，得橙黄色总游离蒽醌。（二）大黄素柱层析分离1．装硅胶层析柱，取100~160目柱层析用硅胶粉10~15g，装入底部垫有少许精制棉花的20×300mm层析柱内，轻轻敲击层析柱，使硅胶粉在柱内均刀充实后，即得干硅胶层析柱。172．柱层析分离：取上述提取项下所得游离蒽醌与硅胶粉混合的样品粉末，仔细加入硅胶层析柱的上端，轻敲层析柱，使样品粉末平整，打开层析柱的下端活塞，缓缓加入适量苯于层析柱中，使苯慢慢渗入柱内，继以苯为洗脱剂进行洗脱，柱下用锥形瓶收集洗脱液。经过一段时间洗脱之后，可以看到在硅胶柱的上段逐渐形成清晰的红棕色两个色带，继续用苯洗脱使两个色带分开较大距离（2cm左右）时改用乙酸乙酯∶苯（28∶）混合溶剂继续洗脱，更换收集容器，直至柱上第一段色带开始流出，控制流出液的流量收集（每15ml为l流分），并顺次编号，直到层析柱上的两个色带全部洗脱下来之后为止。每个流分经薄层层析检查，相同斑点者合并，并分别蒸馏回收溶剂至浓缩。放置析晶，分别滤集结晶。先被洗脱下来的为大黄素甲醚，后被洗脱下来的为大黄素。（三）大黄素PH梯度分离将总蒽醌，加入乙醚约100ml，使完全溶解（或直接用上述的氯仿提取液进行），加5%碳酸钠溶液萃取数次（每次20~30m1），至萃取碱水液呈淡红色为止。合并萃取碱液，加盐酸至呈酸性反应（PH2~3），析出全部大黄素沉淀。抽滤，水洗，再滴稀乙醇抽洗。所得粗制大黄素可用吡啶或冰醋酸重结晶。用碳酸钠液萃取后的乙醚液（方法同上述碳酸钠溶液的处理）。萃取液经酸化后可得大黄素甲醚等弱酸性蒽醌类成份。（四）大黄素的检识1．熔点：大黄素256~257℃2．碱液反应：取实验产品少许，加2ml乙醇溶解，继加氢氧化钠试液2~3滴，溶液立即产生红色，继续加稀盐酸酸化，红色即行退去，试写出反应原理。3．醋酸镁反应：取实验产品少许，加乙醇2ml溶解，加数滴醋酸镁试液，即产生橙红色（或紫红色）。试写出反应原理。4．薄层层析检识吸附剂：硅胶-CMC薄层板展开剂：苯∶乙酸乙酯（82∶）对照品：1%大黄素醇溶液或1%大黄素甲醚溶液供试品：分离后的1%大黄素和1%大黄素甲醚醇溶液显色剂：自然光下观察，再用氨气熏后观察六、实验说明及注意事项l．游离蒽醌的提取方法中，结合状态的羟基蒽醌类成份不溶于氯仿故未被提出。方法一先用10%硫酸与氯仿共同回流，其目的使结合状态蒽醌水解为游离状态蒽醌易被氯仿提取出来，这样提取出的蒽醌类成份较为完全。2．柱层析的硅胶用量，应视上样品量的多少而定，一般是样品与吸附剂之比为1100∶，若用量少则分离效果差，用量过多时又势必使柱体加长，致使洗脱时间减慢。3．如采用湿法装柱，可先在层析管中加入苯液，再通过漏斗将硅胶加入柱中，并始终保持硅胶面上有苯存在。样品上柱时也可采用干法加样，即将总蒽醌溶于少量丙酮，加降活性的硅胶，拌刀放置，待溶剂自然挥发或低温去掉溶剂，小心将其加入柱顶，再以苯洗脱。4．由于大黄酚和大黄素甲醚的极性接近，用硅胶柱层析分离效果不够理想，可采用磷酸氢钙作为吸附剂，以石油醚为洗脱剂，则大黄酚和大黄素甲醚可依18次洗脱下来。5．按照一般常规柱层分离操作，本实验应先用苯洗脱大黄素甲醚，后用苯、乙酸乙酯混合液溶剂洗脱大黄素，但为了实验的进度不致拖延时间，不必全部洗脱大黄素甲醚之后才改换溶剂，只要能看出两个色带明显分离开一定距离时，即可更换溶剂洗脱。这样操作既可有效地将二种成份分开洗脱，又可加速洗脱时间。6．本实验多次使用乙醚，因此要特别注意防火安全，绝对禁止有明火的情况下，使用乙醚。七、思考题1．羟基蒽醌类成份具有哪些性质？根据它的性质，说明提取与分离的原理。2．大黄素的碱液反应和醋酸镁反应的原理是什么？3．如何操作好硅胶柱层析？19