芦丁的提取分离和鉴定

1综合化学实验:芦丁的提取分离和鉴定芦丁简介:芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式:C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。补充知识:2关于苷（gān）和甙(dài):苷类（glycosides，旧称甙）又称配糖体，是糖或糖的衍生物的半缩醛羟基与另一类非糖物质中的羟基以缩醛键（甙键）脱水缩合而成的环状缩醛衍生物，水解后能生成糖与非糖化合物。目前国际上通用“苷”如“皂苷”，而过去习惯使用的中文名称“甙”目前已不再使用如“皂甙”现统称“皂苷”。一、目的要求：1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握化学鉴别试验、苷水解、衍生物制备、熔点和薄层层析检测等手段在苷类结构鉴定上的作用。3、通过UV、IR、HNMR和MS图谱解析，了解光谱方法黄酮类化合物结构鉴定中的作用。二、已知重要成分性质：1.芦丁（rutin）：分子式C27H30O16·3H2O，为浅黄色针状结晶物，mp174～178℃（含三分子水）；100mmHg和110℃加热12小时后，变为无水物，115～117℃软化，214～215℃发泡分解。难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、二硫化碳、苯等，易溶于吡啶，甲酰胺特别是碱液。通常常用的溶剂下其溶解情况为：较难溶于冷水（1：8000～10000），冷乙醇（1：650）；可溶于热水（1：180～200）以及冷甲醇（1：100）；较易溶于热乙醇（1：60）和热甲醇（1：10）。2.槲皮素（quercetin）为芦丁的苷元其分子式为：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。一般在碱水中溶解显黄色。OHOOHOOROHOHR=glurha芦丁R=OH槲皮素33.皂苷（saponin）一般为白色粉末，mp210℃～220℃。易溶于吡啶。能溶于甲醇（1：200），可酸水解得下列两种苷元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。（1）白桦酯醇（betulin）无色针晶，mp215～220℃，能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；难溶于石油醚和水。（2）槐花二醇（sophoradiol）无色针晶，mp219~224℃，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。HOCH2OHHOOH（1）（2）芦丁属于黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，因此可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱等可进行黄酮及糖的鉴定。芦丁酸性条件下水解的过程见下反应方程式：三、提取分离和纯化+鼠李糖+葡萄糖4注1：硼砂因能与芦丁结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，实验证明，提取时加入硼砂，产品质量要好些。注2：加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量的粘液质和酸性树脂（形成钙盐沉淀），但pH不能过高和长时间煮沸，因为会导致芦丁的降解。注3：pH过低会使芦丁形成锌盐而降低收率。四、芦丁的鉴定定性反应鉴别见附录。（一）芦丁的酸水解称取精品芦丁2g置500ml烧瓶中加2%的H2SO4200ml5加热回流1小时放冷，静置，抽滤酸性滤液沉淀中和冷水洗两次，干燥用95%乙醇25ml重结晶中性滤液，结晶时可加入冷水20ml，最后称重，计算收率。浓缩黄色细针状结晶浓缩液（槲皮素）（供糖的鉴定）（二）糖的鉴定（纸色谱法）纸层析鉴定：采用中速层析滤纸（裁剪尺寸：5×20cm）取水解母液20ml，于水浴上加热，同时于搅拌下加BaCO3细粉中和至中性，过滤去多余BaCO3后，滤液浓缩至2~3ml，得样品液供纸色谱点样用。标准对照品：以葡萄糖和鼠李糖标准品作对照（1％葡萄糖标准品醇溶液及1％鼠李糖标准品醇溶液）。展开剂：正丁酵-醋酸-水（BAW）（4：1：5）上层，悬挂并利用上层展开剂纸色谱分离。显色剂：苯胺以及邻苯二甲酸混合试液，喷后105℃烘10分钟。显棕红色斑点。注意事项:纸层析展开时可事先用铅笔在裁剪好的层析纸上画出展开起点(即点样的位置)和预制终点(即展开完毕后展开液的前沿)，这样方便进行测量计算比移值。另外由于糖液一般无色，因此点样位置也可事先用铅笔点出标记，注意如果糖液浓度过低（实验时应尽量将糖液蒸发浓缩至3毫升以内）则应多次点样以达到浓集的目的，否则展开后的点不够明显。点样时也需要注意点样液斑不易扩散太大，应控制液斑直径在3mm以内，同时各点样点之间应尽量保持距离不可过于靠近，否则展开后可能得到较大的样班，而且不同样斑之间可能重合相互干扰而不易测量比移值。下图给出正确的纸层析法标示。6（三）芦丁和槲皮素的薄层层析鉴定吸附剂：硅胶G（400目）以0.4%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水液作为粘合剂制薄层层析板，板片自然阴干后于烘箱中100℃活化1小时。展开剂：（1）CHCl3-MeOH-HCOOH（15：5：1）（2）CHCl3-丁酮-HCOOH（5：3：1）显色剂：1%的FeC13和1%的K3[Fe（CN）6]水溶液，使用时等体积混和。注意：薄层层析点样注意事项依照纸层析7五、实验说明及注意事项1．用石灰水调节芦丁提取溶液的pH，既可以达到碱提取芦丁的目的，还可以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及pH值均不宜过高，否则多余的钙能与芦丁形成螯合物沉淀，同时黄酮结构在强碱性条件下易被破坏。2．调PH时，应注意PH不要过低，因为PH过低（pH2以下）会使芦丁形成钅羊盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母核也会在强碱性条件下被破坏，导致收率下降。3．注意观察槲皮素制备过程中的实验现象。六、思考题1．苷类结构检识的一般程序？2．苷类水解的催化方法？3．怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上？4．怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？5．UV在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。8附录：芦丁的定性检测1．芦丁的定性反应取芦丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：(1)盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HCl、再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。(2)锆-枸试验：取样品液适量，然后加2％ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2％枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。(3)α-萘酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的l0％α-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。2．芦丁的UV(1)鉴定试剂的配制①甲醇钠溶液：取0.25g金属钠，切碎，小心加入色谱甲醇10ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。②三氯化铝溶液：取1g无水三氯化铝，小心加入色谱甲醇20ml中，放置24小时后全部溶解即得。③醋酸钠：用无水粉末醋酸钠。④⑤硼酸饱和溶液：取无水硼酸，加入适量色谱甲醇、制成饱和溶液。（上述贮备液可放置六个月）（2）芦丁溶液的配制精密称取芦丁纯品0.5g，用甲醇适量溶解至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。（3）光谱的测定①甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至200～500nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。②甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后，9立即测定，放置5分钟后再测一次。③三氯化铝光谱，在盛有样品液的石英杯中，加入三氯化铝6滴，放置1分钟后进行测定。测定后加入3滴盐酸溶液（盐酸：水＝1：1）再进行测定。④醋酸钠光谱：取样品液约3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀（杯底剩有约2mg的醋酸钠），加入醋酸钠后两分钟内测定，5分钟到10分钟后再测定一次。3．芦丁及槲皮素的色谱支持剂：中速层析滤纸（5×20cm）展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层样品：自制槲皮素的乙醇溶液自制芦丁的乙醇溶液对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液芦丁标准品的乙醇溶液显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾10预习报告及实验报告格式和要求：预习报告：1、实验目的2、实验原理3、实验步骤：（1）要求将实验内容分拆，并画出流程图（2）要求写明各试剂的用途和各步骤的目的和实验原理4、回答指导教师提出的问题实验报告：实验报告一律每班用一样大小软皮本，正面写实验报告，背面写实验记录，上课前交预习报告和上一次的实验报告（预习报告和实验报告写一份即可）。组号同组人（预习报告完成）天气情况实验室温度湿度（预习报告完成）1、实验目的（预习报告完成）2、实验原理（预习报告完成）3、实验步骤：（1）要求将实验内容分拆，并画出流程图（预习报告完成）（2）要求写明各试剂的用量和加入时间（实验报告完成）（3）要求写明各试剂的用途和各步骤的目的和实验原理（实验11报告完成）4、实验数据5、描述实验结果6、对实验数据进行处理和分析，并分析实验结果的合理性。（实验后完成）7、回答讲义后思考题