核酸分子杂交技术

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1核酸分子杂交技术nucleicacidhybridization医学分子生物学.第八章温州医学院检验医学院ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2主要内容•第一节核酸杂交概述及基本原理•第二节核酸探针技术•第三节核酸分子杂交技术•第四节基因芯片ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics3•核酸定性或定量检测•基因克隆、突变及其表达研究•疾病的临床诊断主要用途ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics4第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述二、核酸变性三、核酸复性四、核酸分子杂交ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics5•1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；•60年代中期Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础；•70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics6•80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；•90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics7第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述-核酸的结构•一级结构：核苷酸的排列循序–稳定键：磷酸二酯键•二级结构：双螺旋结构–稳定键：氢键、碱基堆积力、疏水键•高级结构：染色体ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics8CGA一级结构二级结构高级结构ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics9第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到蒲怀，DNA由双螺旋变成单链过程。•化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的•化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics10ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics11–加热–极端的pH–有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-DNA的变性因素ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics12变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的性质–溶液黏度降低•DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降–溶液旋光性发生改变•变性后DNA分子的对称性及局部构型改变–紫外吸收增加•DNA变性后，DNA溶液的紫外吸收增强•双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics13DNA的紫外吸收光谱增色效应（hyperchromiceffect）：DNA变性时其溶液OD260增高的现象第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的增色效应ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics14•DNA分子在250－280nm波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm•紫外吸收的结构基础是：DNA分子中碱基间电子的相互作用，变性后，双链解开，碱基间电子的相互作用更有利于紫外吸收，产生增色效应•增色效应可以作为DNA变性的指标•不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20－30%之间第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-变性DNA的增色效应ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics15第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-解链曲线通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度（A260）的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics16第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度•增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于DNA自身的性质。融解温度（meltingtemperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics17特点：•爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度•狭窄性：变性温度范围很小第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics18Tm的影响因素：1．DNA分子大小和碱基的组成2．溶液的离子强度3．pH值4．变性剂DNA复杂度对Tm的影响第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics19（一）DNA分子大小和碱基的组成不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的–DNA的均一性–DNA的（G+C）含量第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics20DNA的均一性有二种含义–DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行–待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics21DNA的（G+C）含量•在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量•（G+C）含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。–因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量。第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics22Tm与（G+C）含量的关系•Tm与DNA中（G+C）含量存在着密切相关性•Tm与（G+C）含量（X）百分数的这种关系可用以下经验公式表示（DNA溶于0.2mol/LNaCl中）:Tm=69.3+0.41（G+C）%•核苷酸≤20bpTm=4（G+C）+2（A+T）第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics23（二）溶液的离子强度•溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性•离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics24（三）pH值•pH值影响氢键的形成•pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于4时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics25（四）变性剂•干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等第一节核酸杂交概述及基本原理二、核酸变性-融解温度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics26•双链DNA、RNA双链区、DNA:RNA杂交双链（hybridduplex）以及其它异源双链核酸分子（heteroduplex）都具有此性质第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性复性（renaturation）：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics27DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响：第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素•温度和时间•DNA浓度•DNA分子大小和复杂度•离子强度ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics28温度和时间•一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢•复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics29DNA浓度•DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”•“成核”速度与DNA浓度的平方成正比•溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics30DNA分子大小和复杂度•用非重复碱基对（bp）数表示核酸分子的复杂性。•多聚（A）的复杂性为1，重复的（ATGC）n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是105核苷酸的非重复DNA序列的复杂性为105•原核生物基因组均为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接与基因组大小成正比•真核生物基因组中的非重复片段也是如此第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics31DNA顺序的复杂性对复性的影响•简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现•顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics32离子强度对复性的影响•增加盐浓度可怎见互补链合成双链的速度，盐中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥第一节核酸杂交概述及基本原理三、核酸复性-影响因素ZhejiangProvincialKeyLabo