生命科学前沿专题---李培金

生命科学前沿专题（基因编辑技术）于军杨焕明1985杜尔贝克,1990:人类基因组计划Howtousethegenomesequences?个性化测序在模式物种：拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等等；农作物和经济作物：水稻、玉米、大豆、甘蓝、白菜、高粱、黄瓜、西瓜、马铃薯、番茄、拟南芥、杨树、麻风树、苹果、桃、葡萄、花生；药用：真菌类，例如灵芝、茯苓等，以及一些药用植物，例如丹参、长春花等还有：牡蛎、大黄鱼、石斑鱼和半滑舌鳎、鲤鱼和白鳍豚、白鳍豚、小须鲸、扬子鳄和南美白对虾………..ThedogmaofGenetics—中心法则RNA调控RNAi作用原理回顾RNA干扰（RNAi）作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）。靶向基因编辑技术染色体-核小体-DNA人类：1、大约有2米；2、60亿个碱基；3、组蛋白的包裹；4、4种碱基的组合。ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。•锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；•人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；•构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。ZFN缺点：1、Sangamo生物公司专利；2、设计复杂。TALEN技术基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技术是一种较新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。2007年发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译由34个氨基酸组成一个单元模块，重复17-18次34个氨基酸中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基TALEN发展过程人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对TALEN基因敲除FokITAL靶点识别模块FokIFokITAL靶点识别模块X2TALEN表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm点突变片段删除基因敲入TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程1.选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X2X2X2MutMut•TAL的核酸识别单元为34氨基酸模块中的双连氨基酸（RVD）•RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确•欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14-18个）串联克隆即可。TALE识别模块串联构建TALEN的实现步骤（1）TALEN的实现步骤（2）ZFN和TALEN技术的比较曾经的天方夜谭已变得触手可及,改变人类遗传的技术已近在眼前，我们需要决定，我们的社会该怎样运用这种能力。就像计算机之于算盘——或者换个更黑化的场景——就像机关枪之于长矛般天差地别。---DavidBaltimore(加州理工学院)PK一项技术引发的的专利大战2015.1美国硅谷300万美元“科学突破奖”JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentie麻省理工,张锋依靠4300万美元的风险投资创办了EditasMedicineCRISPRCRISPR文章的发表3100万元的基金走向CRISPRCRISPR-Cas系统基因修饰技术2007年，Danisco这家来自丹麦哥本哈根的食品原料公司（现在该公司已经被DuPont公司收购）的科学家们发现了一种方法，能够极大地增强工业细菌对噬菌体的抵抗力。他们的方法就是用噬菌体来免疫细菌，结果取得了很不错的效果（Science,23March2007,p.1650）。DuPont公司收购了Danisco公司之后，利用这种技术培育出了抵抗力更强的工业生产用菌。而且这项工作还证明，细菌也是拥有适应性免疫系统（adaptiveimmunesystem）的，而且依靠这种免疫机制抵抗同一种噬菌体的多次攻击。2013以后，研究者们在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。1、CRISPR-Cas系统的发现CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。发现发现发现CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。发现Biotechnology:RewritingagenomeNature495,50–51(07March2013)doi:10.1038/495050a发现2CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成：识别切割概述结构CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常21~48bp,重复序列之间被26~72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。1.1CRISPR结构Cas家族Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）为NGG。靶向要求在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGGPAM。靶向要求3CRISPR-Cas系统介导基因修饰3.1dual-RNA：Cas介导编辑模板替换2013年1月29日在《naturebiotechnology》上发表的《RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。3.1dual-RNA：Cas介导编辑模板替换3.2sg-RNA：Cas介导基因修饰2013年1月29日在《naturebiotechnology》上发表的《efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。3.2sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2sg-RNA：Cas介导基因修饰Cas9sg-RNA2013年2月15日在《science》上发表的《MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems》一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。3.3cr-RNA：Cas介导双基因修饰3.3cr-RNA：Cas介导双基因修饰3.4Cas介导基因启动2014年，重大突破！张锋Nature发文：CRISPR可启动任何基因4CRISPR-Cas系统前景分析这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。4CRISPR-Cas系统前景分析2013年4月12日在《cellstemcell》上发表的《EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。4CRISPR-Cas系统前景分析而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。中科院遗传与发育所，GaoCaixiaWTCRISPR株系CRISPR作用原理回顾(1)CRISPR作用原理回顾（2）---Science,2013.84CRISPR-Cas系统前景分析只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。技术优势2016.13篇Science文章/杜氏肌营养不良种X染色体隐性遗传疾病先失去行走能力失去呼吸功能大约在25岁左右死亡正常肌细胞杜氏细胞CRISPR处理“我还没有发现在哪个领域内，有哪种技术能够像CRISPR技术这样发展得如此迅猛。”——美国蒙大拿州立大学BlakeWiedenheft“CRISPR方法真心很强大，现在我们实验室几乎每一项目都会用到这项技术。”——麻省理工学院科赫研究所综合癌症研究中心的TylerJacksCRISPR:名词》》》动词1.OrthogonalgeneknockoutandactivationwithacatalyticallyactiveCas9nuclease.DahlmanJE,AbudayyehOO,JoungJ,GootenbergJS,ZhangF,KonermannS.NatBiotechnol.Oct5.(2015).33(11):1159-1161.2.Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem.ZetscheB,Gooten