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第七章重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。第一节载体表型选择法1.原理：pBR322（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。也可以用含青霉素的培养基直接筛选。青霉素分子不消耗碘，其降解产物青霉酮酸消耗碘，因此可根据碘的显色反应确定氨苄青霉素抗性基因是否失活。蓝色碘没有消耗青霉素没降解阳性克隆抗药性标记选择应注意的问题抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定转化子菌落的培养时间不宜过长，以12－16小时为宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌落会降解选择药物，导致非阳性转化子菌落周围选择药物浓度降低。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。2.选择过程-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节DNA电泳检测法分子量Marker载体重组克隆二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，电泳后比较结果是否符合预计的结果。ABA或B不同克隆的酶切结果表型筛选加酶切筛选AATTAATT插入片段三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸杂交第四节核酸杂交检测法一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P或125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片段互补的序列。（2）非放射性标记荧光素二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片段的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切后插入片段载体含插入片段插入片段探针杂交结果Southernblot筛选结果（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。2）原理：3）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。1）R-环：R-环：是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。缺点：需要电镜！2.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片段是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法第五节免疫化学检测法1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗2.放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。重组质粒重组质粒重组质粒固相支持滤膜抗A抗体125I标记的抗B抗体质粒蛋白A外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支持滤膜抗A抗体发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原—抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbant(免疫吸收剂)assay1.原理：一抗（primaryantibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）:由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。临床检验常用的单抗四、免疫印迹（westernblotting）法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。①SDS:（SDS-PAGE）：②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer点样电泳方向③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿Dalton④凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度低、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色直接染色电泳结果（2）Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白Western装置②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程④结果单抗blotting结果一、无细胞翻译系统第六节转译筛选法能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？三、杂交抑制转译法mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链mRNA核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译mRNADNA核糖体小亚基核糖体大亚基不能翻译1.原理2.过程四、杂交释放转译法1.原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。2.过程硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA总mRNAcDNA基因的mRNA杂交洗脱cDNA基因的mRNA体外翻译cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA收集35S标记的氨基酸专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记五、DNA-蛋白质相互作用筛选法一般克隆与筛选策略第七节几种常用的真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳动物基因转移的选择标记1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK选择原理①四氢叶酸的必要性DHFR②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMPdATPTTPdCTP氨甲喋啉抑制抑制④胸苷酸激酶的补救作用TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成dTTP，存活。Ttk③次黄嘌呤的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。dUMPdATPdTTPdCTP次黄嘌呤补救氨甲喋啉抑制抑制①HAT培养基：Tk-细胞株。TK基因。②宿主细胞③载体标记（2）TK选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入TK基因的细胞才能生存。真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。2.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1）选择原理①二氢叶酸还