第七章遗传重组

1第七章基因重组2第一节基因重组概述一、遗传重组的概念重组：已存在的遗传物质产生新组合的过程；分子间或染色体间重组：通过混合离散染色体产生新的组合。如孟德尔遗传学中非同源染色体的自由组合等现象；分子内或染色体内重组：指由于不同DNA链的剪切和连接而产生DNA片段的交换和重新组合形成新的DNA分子的过程。3二、分子内重组类型同源重组：发生在同源序列间。调节蛋白(如大肠杆菌RecA蛋白)不是序列专一性的，而是同源依赖的。真核生物有丝分裂、减数分裂过程中广泛存在；位点特异性重组：供体和受体分子重组部分通常有一短的同源序列。位点特异性重组酶识别该特异位点，调节这一过程需要多种蛋白的协调作用；4转座重组：不需要同源序列。调节这一过程的蛋白(转座酶、整合酶)识别重组分子中短特异性序列；异常重组(illegitimaterecombination)：发生于非同源序列之间，是细胞异常作用的结果。包括复制中不正常末端连接，链滑动或成环。人工重组：体外使用纯化的酶和底物进行的DNA连接。5大肠杆菌四种遗传重组的一般特征类型同源序列RecA蛋白序列特异性酶同源重组需要需要不需要位点特异性重组需特定短序列不需要需要转座重组不需要不需要需要异常重组不需要不需要？6第二节同源重组(homologousrecombination)7一、同源重组的基本特征同源重组是同源依赖的，不是序列依赖的；重组时两条同源链经过断裂和重接，形成新的双链分子；交换位点可发生在同源区任何位置上；交换位点上，两个双链分子的各一条链进行碱基配对，产生不同DNA双链之间的连接区或联会点；依靠recA的重组产生一个四条链的Holliday中间体。8二、同源重组的两个基本功能遗传混合DNA修复9Holliday模型：重组发生在异源双链间，涉及DNA链的打断和重新连接产生新的分子；Meselson-Radding模型：DNA双链断裂引发重组，在DNA修复中重组发生。三、同源重组模型101、同源重组与减数分裂Recombinationoccursduringthefirstmeioticprophase.Thestagesofprophasearedefinedbytheappearanceofthechromosomes,eachofwhichconsistsoftworeplicas(sisterchromatids).Themolecularinteractionsofanyindividualcrossing-overeventinvolvetwoofthefourduplexDNAs.细线期合线期粗线期双线期终变期112、Holliday重组模型1）两个具同源序列的DNA双螺旋分子排列在一起(1)；2）切断：核酸酶和RecBC蛋白复合体作用下在一对姐妹染色单体产生切口，切口发生在约相隔4kb就有一个的chi（GCTGCTGG）序列(2)；3）侵入：含有5’端切口的单链DNA被RecA蛋白包裹形成RecA-ssDNA细丝，这些相互细丝交换并寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列(3)；(1)5’AB3’(8)A3’5’B3’5’5’ab3’两臂旋转联会(2)5’AB3’b3’5’a3’5’5’ab3’(9)A酶切B(3)5’AB3’3’5’b3’5’a5’ab3’游离端移动联会(4)5’AB3’(10)AA3’5’BB3’5’5’ab3’游离端交叉连接bb(5)5’AB3’aa3’5’3’5’(11)ABAb5’ab3形成单链交叉abaB(6)5’AB3’3’5’3’5ABAb5’ab3’分支点移动(7)AabaBBab图23－8Holiday重组模型。124）Holliday中间体：切口封闭形成Holliday中间体(4,5)；5）分支迁移：两条DNA分子间的交叉点可以沿DNA移动；移动实际上是两条DNA分子间交叉的同源单链互相置换的结果(6);6）Holliday中间体旋转变构(8&9)；(1)5’AB3’(8)A3’5’B3’5’5’ab3’两臂旋转联会(2)5’AB3’b3’5’a3’5’5’ab3’(9)A酶切B(3)5’AB3’3’5’b3’5’a5’ab3’游离端移动联会(4)5’AB3’(10)AA3’5’BB3’5’5’ab3’游离端交叉连接bb(5)5’AB3’aa3’5’3’5’(11)ABAb5’ab3形成单链交叉abaB(6)5’AB3’3’5’3’5ABAb5’ab3’分支点移动(7)AabaBBab图23－8Holiday重组模型。(1)5’AB3’(8)A3’5’B3’5’5’ab3’两臂旋转联会(2)5’AB3’b3’5’a3’5’5’ab3’(9)A酶切B(3)5’AB3’3’5’b3’5’a5’ab3’游离端移动联会(4)5’AB3’(10)AA3’5’BB3’5’5’ab3’游离端交叉连接bb(5)5’AB3’aa3’5’3’5’(11)ABAb5’ab3形成单链交叉abaB(6)5’AB3’3’5’3’5ABAb5’ab3’分支点移动(7)AabaBBab图23－8Holiday重组模型。137）Holliday中间体拆分（二次切断），可以有两种情况：Holliday中间体二次切割发生在原断裂的两条单链上，称为非交换型重组，双链中存在异源区域(图10,11,12)；Holliday中间体二次切割发生在另外两条单链上，称为交换型重组(图10’,11’,12’)。(1)5’AB3’(8)A3’5’B3’5’5’ab3’两臂旋转联会(2)5’AB3’b3’5’a3’5’5’ab3’(9)A酶切B(3)5’AB3’3’5’b3’5’a5’ab3’游离端移动联会(4)5’AB3’(10)AA3’5’BB3’5’5’ab3’游离端交叉连接bb(5)5’AB3’aa3’5’3’5’(11)ABAb5’ab3形成单链交叉abaB(6)5’AB3’3’5’3’5ABAb5’ab3’分支点移动(7)AabaBBab图23－8Holiday重组模型。14Holliday模型1.联会：同源双链配对；2.切刻：联会两分子中各发生一个单链断裂；3.链交换：断裂单链进行重新碱基配对交换，形成Holliday构型；4.分支移动：使Holliday构型交叉点移位；5.产生二次切刻；6.切刻封闭产生重组分子。153、Meselson-Radding双链断裂模型164、环状DNA同源重组过程1）双链环状DNA同源重组形成每条DNA分子首尾相连的8字型中间体；2）8字型中间体的拆分有两种形式：一是产生两个亲体环状DNA分子，但每个各含有一段异源双链区；产生一个由两个亲体DNA分子首尾共价连接而成的二聚环。175、同源重组模型的实验验证Holliday中间体的电镜观察：电镜下可观察到X174、大肠杆菌质粒等的“8”字形结构；用单一切点酶处理“8”字形分子，则形成具有两对相同长度臂的型分子(b,c)，说明两个分子通过同源区共价连接的。18四、细菌的重组1、转化中的重组感受态细胞表面有一种DNA结合蛋白因子，特异性结合双链DNA；在内切核酸酶作用下，一条链被降解，另一条链被吸收到细胞质内；被吸收的单链DNA与蛋白质结合生成遮蔽复合物，保护单链DNA免受核酸酶的降解；“遮蔽”复合物把单链DNA带至受体染色体，通过彼此的重组，单链DNA片段整合到染色体上，置换了宿主染色体的同源部分生成带有错配碱基对的杂合区；整合过程中产生的错配通过修复机制进行修复。19转化机制转化过程中recA蛋白质起着重要作用202、细菌接合中的重组1）接合：细胞直接接触，供体DNA通过专门的接合管转移至受体细胞，过程由致育因子F质粒来完成；2）接合重组过程F+细胞性纤毛与F细胞表面特异识别位点作用，形成接合管或接合桥；当接合发生在F+及F之间时，F质粒编码的特异内切酶在oriT位点上打开缺口，F+DNA的一条单链留下复制恢复其双链状态，另一条进入受体细胞的单链以不连续方式合成互补链。染色体上一些特殊区域与F因子的某些部位有同源性，可以让F因子插入，生成Hfr细胞；当Hfr与F结合时，Hfr染色体的转移是以单链形式进行，并以单链形式通过一般重组与寄主染色体整合；F质粒整合需要寄主重组系统RecA蛋白和RecBC蛋白。21F因子插入模型染色体上一些特殊区域与F因子的某些部位有同源性，可以让F因子插入，生成Hfr细胞。223、细菌转导中的重组1）转导：供体细胞基因通过噬菌体运载进入受体；普遍性转导：被转导DNA片段是随机的；专一性转导：转移的染色体DNA是特定片段。2）转导重组的一般特征转导遗传重组都在双链DNA片段和完整DNA分子间发生；转导的重组过程与两个完整DNA分子的重组相类似，起始于单链侵入和取代；转导也需要RecA和RecBC蛋白质。23五、同源重组过程的酶学1、RecA蛋白又称做重组酶，分子量约38kD，由recA基因编码，为含4个亚基的四聚体；2、RecA是同源重组最重要的蛋白，主要功能是促进DNA分子同源联会和DNA分子间的单链交换。（一）RecA蛋白质243、与重组有关的活性单链DNA结合活性：形成的复合物是DNA单链交换中的活性形式；双链DNA结合活性：依赖于ATP，RecA与双链DNA结合导致解链，并最终促使RecA与单链DNA的结合；NTP酶活性：单链或双链DNA存在时，该蛋白可水解NTP并与DNA结合；但只有ATP水解才能促进联会；促进互补单链复性的能力。254、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP），RecA蛋白即被活化；活化的RecA将双螺旋解旋和分离，同时试图将其结合的单链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部分）。新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。2627RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会参与联会的DNA分子可以是多种不同的形态分子的组合；但无论那种组合，其中一个分子是单链分子，或者有足够长度的单链区。28（二）RecBCD蛋白质1、RecBCD酶由recB、recC、recD基因编码。2、RecBCD酶的活性作用于单、双链DNA的外切酶活性，因此又称做核酸外切酶V，依赖于ATP；线形DNA的解旋酶活性；序列特异性的单链内切酶活性。29RecBCD酶在含有游离双螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用。它结合在双螺旋游离端，利用ATP的能量沿双螺旋前进，经过处DNA解旋又复旋。RecBCD酶在Chi位点上促进重组作用。Chi核苷酸顺序是5’GCTGGTGG3’，是重组频率较高的部位。当解旋的DNA链上有Chi位点时，RecBCD酶出现特异的核酸酶活性，将靠近Chi处（约离Chi4-6碱基处）的单链切断。3、RecBCD的功能30RecBCD结合在双链断裂处chiBCD5’3’RecBCD解链并作为外切酶降解DNAchiRecBCD停留在chi处，内切酶切开单链RecD在chi顺序解离RecBC继续作为解链酶图23-15RecBCD核酸酶从一侧接近chi顺序，当它前进时降解DNA。在chi位点它作为内切酶剪切单链，释放RecD,仅保留了解链酶活性。3132（三）RecE和RecF蛋白质recA突变株的重组频率为10-6，recA、recBC-突变株的重组频率为10-2，残存的重组活力依赖于RecF途径；recE基因编码外切核酸酶VIII，能提高RecF途径的重组效率；该酶对单链DNA只有少量活性，对双链DNA活力较高，无内切核酸酶活力，是一种不依赖于ATP的核酸酶。大肠杆菌同源重组有两条途径：主要是RecBCD途径，次要途径为RecF。33第三节位点特异性重组(site-specificrecombination)34一、位点特异性重组的一般特点发生在两对DNA分子特定位点间，是涉及一段互补碱基的配对和交换的重组过程；不依赖于DNA顺序同源性（虽然亦