RACE原理及实验步骤

™RACEcDNAAmplificationKitUserManualTableofContents成分及另备物品引物设计PolyA+RNA和总RNA的制备3'-RACE和5'-RACE的基本原理RACE产物鉴定PCR阳性对照cDNA第一链的合成cDNA末端快速扩增SMART技术原理：在合成cDNA的反应中事先加进的3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。一、成分及另备物品保存条件：1.ControlHumanPlacentalTotalRNA和BDSMARTIIAOligonucleotide在–70°C下保存。2.NucleoTrapGelExtractionKit室温下保存。3.其余试剂–20°C下保存。另备物品下列试剂需另外准备：由于SMART™RACEcDNAAmplificationKit没有PCRpolymerase，可以使用以下物品：Advantage2PCRKit(Cat.Nos.639206/639207)Advantage2PolymeraseMix(Cat.Nos.639201/639202)二、引物设计A引物序列B引物在基因上的位置C降落PCRD巢式引物A.引物序列特异引物(GSPs)应当：•23–28个核苷酸•GC含量为50–70%•Tm大于或等于65°C，如果Tm70°C可获得最好的结果(可使用降落PCR)。•至少需要两个特异引物才能进行完整的BDSMARTRACE：即用于5'-RACEPCR的反义引物和用于3'-RACEPCR的正义引物。如果只进行5'-或3'-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。模版、引物及RACE产物下图所示。Therelationshipofgene-specificprimerstothecDNAtemplate.B.引物在基因上的位置•BDSMARTRACEKit得到的扩增产物大于6.5kb•对引物加以筛选，使5'-和3'-RACE产物达到2kbC.降落PCR•明显增加BDSMARTRACE扩增的特异性•降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm高于通用引物的Tm。•退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。•当引物的Tm70°C时建议使用降落循环程序。D.巢式引物在首次试验时，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（UPM）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非特异性背景的RACE产物。但是，巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Southernblotting中使用。此外巢式PCR在使用特异引物进行5'-or3'-RACE存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用。在巢式PCR中，使用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。BDSMARTRACE指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物能够被使用的地方。本试剂盒提供的通用巢式引物A可用于5'-and3'-RACE。按照上述指南可以设计巢式特异引物。巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列有限而必须重叠，其内部引物的3'末端的序列也要尽可能唯一。中文名称：巢式引物英文名称：nestedprimer定义：为巢式聚合酶链反应所设计的引物，第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的。三、总RNA和PolyA+RNA的制备A.总的预防B.RNA分离C.RNA分析推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测RNA样品。哺乳动物的总RNA展示为两条4.5和1.9kb的带，分别对应28S和18S核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为1–2:1。哺乳动物的PolyA+RNA会产生0.5–12kb的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。RNA分析RACE四、3'-RACE、5'-RACE基本原理经典的RACE技术是Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点。race定义：cDNA末端快速扩增技术（rapidamplificationofcDNAends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：利用锁定引物（（lockdockingprimer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；1在5'端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）2采用RNaseH-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃-70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；3采用热启动PCR（hotstartPCR）技术和降落PCR（touchdownPCR）提高PCR反应的特异性。43'-RACE基本原理利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（genespecificprimer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universalprimer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3'末端的DNA片段扩增出来。3’RACE流程图SMARTTM5'-RACE的原理先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universalprimer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP2genespecificprimer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。5’RACE流程图五、cDNA末端的快速扩增(RACE)主要步骤：1、PCR反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5'-和3'-RACE反应。对于50-µlPCR反应，所混合的成份如下：2、漩涡混合（不要产生气泡），短暂离心。*如果RNA是非人类的，可以跳过此步†如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。3.对于5'-RACE:按表III准备PCR反应；在0.5-mlPCR管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。*如果RNA是非人类的，可以跳过此步†如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。对于3'-RACE:按表IV准备PCR反应在0.5-mlPCR管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。4.每管内覆盖2滴矿物油，加盖。Note:.如使用热盖循环仪则不必加矿物油。5.使用下列程序之一启动循环仪，(programs1和2用于5'-和3'-RACETFR和UPMPrimers的阳性对照)。依据所使用的是polyA+还是总RNA来选择正确的循环次数。六、RACE产物的鉴定RACE产物的鉴定使用3种方法：(A)对比用GSPs和NGSPs得到的RACE产物；(B)Southernblotting；(C)克隆和测序。A和B需要巢式引物。A.对比用GSPs和NGSPs得到的RACE产物：对于5'-RACE反应，将UPMMix和GSP1得到的初级扩增产物与UPM和NGSP1得到的扩增产物进行对比(对于3'-RACE，将UPM和GSP2与UPM和NGSP2的扩增产物进行对比)。当有多条扩增带时，巢式引物的扩增带应当稍小些，其中一些带应当消失。Note:不要使用NestedUniversalPrimerA(NUP)。Southernblotting：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。B.SouthernBlotAnalysis当RACE产物有多条带时，用GSPs或NGSPs制作探针进行Southernblot可以有把握地确认真正的RACE产物带。通常5'-RACE比3'-RACE易出现多条带。1.琼脂糖凝胶电泳检测RACE产物。2.照相、转尼龙膜。3.准备探针，探针内不能有GSP1(orGSP2)的序列。可以将NGSP1(orNGSP2)进行末端标记。如果GSPs的5'和3'产物有重叠，则可以用GSP2做探针鉴定5'-RACE产物，用GSP1做探针鉴定3'-RACE产物。使用cDNA进行缺口翻译或随机引物扩增都可以制作探针。4.杂交、曝光、显影。5.与琼脂糖凝胶电泳照片进行对比。6.一旦得到了目的条带，使用NucleoTrapGelExtractionKit进行胶回收，分离DNA。C.RACE产物的克隆和测序：1.使用NucleoTrapGelExtractionKit进行RACE产物的回收和纯化，直接克隆到T/A类型的PCR克隆载体上。2.使用32P-标记的NGSP进行菌落杂交或从GSP处开始测序，验证克隆的插入。对于5'-RACE产物，推荐至少挑取8–10单克隆，以便在5'末端获得最大量的序列。一旦确认克隆内含有最大的特异基因的插入子，就尽可能获取较多的序列数据。可以得到完整ORF以及5'和3UTR。七、cDNA的第一链合成注意事项主要步骤：1.在0.5-ml微型离心管中加入下列试剂：2.加入消毒水至终体积为5µl。3.混合并在小型离心机上短暂离心。4.70°C下温育2min。5.迅速在冰上冷却2min。7.在每个反应管中再加入下列试剂（已有5µl体积）：2µl5XFirst-StrandBuffer1µlDTT(20mM)1µldNTPMix(10mM)1µlBDPowerScriptReverseTranscriptase总体积为10µl6.短暂离心使