第四章---灭菌

第四章灭菌(sterilization)第一节灭菌的原理及方法第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺第三节空气除菌灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。第一节灭菌的原理及方法一、几种常见的灭菌方法1化学物质灭菌原理：药物与微生物细胞中的成分发生反应而具有杀菌作用，如使蛋白质变性或酶失活。常用的灭菌剂:使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌2.辐射灭菌原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用：紫外线、X射线和γ射线。使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌3．干热灭菌原理：利用高温对微生物进行有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：火焰灼烧和电热箱加热，140-180℃1-2小时使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌4．过滤除菌原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。方法:0.01~0.45m孔径滤膜，使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。5．湿热灭菌原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。常用方法：水煮常压灭菌：100℃饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟使用范围：培养基和发酵设备灭菌。二、湿热灭菌原理1.生物热死动力学（对数残留定律）-dN/dt=KNN：残留活菌体个数（个）t:灭菌时间（min）k：灭菌速率常数（min-1）dN/dt:菌受热死亡速率(个/min)LnN/N0=-KtN/N0=e-Kt以菌的残留数N/N0的对数与时间t作图，得出一条直线，其斜率为-K（P66图4-5）如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度，某一微生物的K？2.反应速率常数K1).K与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热，k值越小。相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。2).K与灭菌温度有关K=Ae–E/RT（阿累尼乌斯方程）LnK=LnA-E/RTA：比例常数R：气体常数(J/molK)T：绝对温度(K)△E：杀死细菌所需的活化能（J/mol）第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺一、培养基灭菌时间的选择t=1/k×Ln(N0/N)其中K：一般耐热的细菌芽孢的K值N0：细菌及芽孢数之和N：10-3二、培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度1.培养基营养成分破坏动力学方程-dC/dt=K’C-dC/dt:营养物降解速度mol/LsC:营养物浓度mol/LK’:营养物降解反应速度常数1/st：时间(S)Ln(C/C0)=-K'tK’=A’e-E’/RTLnK’=LnA’-E’/RTA’：阿累尼乌斯常数(s-1)R：气体常数8.314J/(molK)T：绝对温度(K)E’：营养物破坏所需的活化能（J/mol）2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能E＞E’P68表4-43.灭菌反应营养物破坏反应T1LnK1=LnA-E/RT1LnK1’=LnA’-E’/RT1T2LnK2=LnA-E/RT2LnK2’=LnA’-E’/RT2Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2’/K1’)=E’/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=ELn(K2’/K1’)E’Ln(K2/K1)＞Ln(K2’/K1’)K2/K1＞K2’/K1’当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大4．达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好三、影响灭菌效果的因素微生物种类：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不变的前提下，t与初始菌量N0的对数成正比。培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。液体：传热与混合状况，影响受热均匀度。固体：培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。泡沫：蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。pH：酸性pH下可加快微生物热死速率四、培养基和发酵设备的灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅手提式灭菌锅。容量小。立式或卧式灭菌锅。容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。（二）分批灭菌(batchsterilization)1．定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。也称实罐灭菌。2．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度，并通入无菌空气保压。分批灭菌设备示意图三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气温度随灭菌时间的变化（三）连续灭菌(continuoussterilization)1．定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。2．流程：1)由热交换器组成的灭菌系统2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统四）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌优点：1．不需附加设备2．蒸汽利用率高3．节约劳动力缺点1．培养基质量比较差2．罐的利用率低3.冷却水用量大连续灭菌优点：1采用高温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3．有利于自动控制4．节省冷却水缺点1．投资费用高2．对物料要求高3．蒸汽用量大选择原则：1．培养基成份（易降解成分、液化情况等）2．设备状况（冷却面积、传动装置等）3.动力条件五、高温对培养基成分的有害影响及其防止消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌第二节空气除菌一、无菌空气的要求1.空气中的微生物•空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。•这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103~104个／米3。•灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm）•无菌空气的标准百分数：99.99％美国联邦宇航局等级标准：100级（直径大于0.5微米粒子数少于3.5个/L）温度：25℃—40℃湿度：30%—45%二、介质除菌：原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。主要设备：填充床过滤器1.纤维或颗粒介质填充床过滤器：棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：超细玻璃纤维3.烧结金属、陶瓷过滤器发酵生产中制备无菌空气的大致过程空气介质除菌流程•高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。•三、膜过滤（绝对过滤）••原理：利用微孔滤膜（microporousmembrane）对空气进行过滤，膜的孔径0.2-0.45微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。•膜过滤器：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、聚丙烯、纤维素脂膜等