流式细胞术及应用文金生博士温州医学院,微免教研室2009年10月27日一、流式细胞术工作原理二、荧光染料选择三、抗体选择四、样品制备及对照设置五、数据分析处理六、流式细胞术的应用内容一、流式细胞术工作原理(一)流式细胞术的概念流式细胞术(FCM,FlowCytomytry)指利用流式细胞仪(FlowCytomyter)对处于快速流动的荧光染色的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选(纯度可达99%以上)的技术。凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒,都可用流式细胞仪检测。特点:1、测量速度快,每秒钟测数千至上万个细胞;2、可进行多参数测量;3、可把指定特征的细胞分离出来(分选技术)。美国B-D公司型号:FACSCalibur(二)、流式细胞仪工作示意喷嘴荧光信号激光鞘液(三)、流式细胞仪光信号1、散射光信号:FSC和SSC前向散射光信号(FSC):与激光束方向同轴的称前向散射光信号,反映细胞大小,细胞越大,前向散射光信号越强;FSC信号与细胞的折射率有关,可用于表示细胞的凋亡,区分死/活细胞时,可用于设门。侧向散射光信号(SSC):与激光束方向垂直的称为侧向散射光信号,主要反映了细胞的内部结构,内部结构越复杂,SSC信号越强,反映细胞内颗粒性。外周全血细胞(红细胞溶解后),FSC和SSC。1、散射光信号中性粒细胞单核细胞淋巴细胞荧光素与特异抗体结合(荧光抗体)或荧光素;荧光素吸收激光(激发光波长)能量;荧光素释放光量子(发射光波长);荧光抗体与细胞抗原结合越多,荧光信号越强;荧光素与细胞核酸结合,荧光强度(FL)反映核酸含量;荧光强度可区分荧光标记细胞与无荧光标记细胞,也可区分高FL细胞与低FL细胞。一般的流式细胞仪装有一个激光光源(488nm),可测出三个FL,即FL1、FL2、FL3,大型的流式细胞仪装有三个激光光源(488nm、633nm和407nm),可测出13个FL。2、荧光信号双色直接染色2、荧光信号二、荧光染料的选择选择荧光染料要考虑:1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料;2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长;3、使用多种荧光染料时,要考虑荧光染料之间的干扰。PE-Cy5与APC干扰。FITC:异硫氰酸荧光素,绿色,513nmPE:藻红素,橙黄色575nm,信号最强PerCP:多甲藻黄素-叶绿素蛋白,深红色,675nmPE-Cy5(PC5):670nmPE-Cy5.5(PC5.5):667nmPE-Cy7(PC7):767nmPI(碘化丙啶):617nm二、荧光染料的选择488nm激光激发的染料:633nm激光激发的染料:APC:异藻蓝蛋白,红色660nm非特异性荧光来源:自发荧光检测自发荧光水平高的细胞时,使用发射光波长较长的荧光染料(如APC),可以得到较好的S/N比值。自发荧光不太高的细胞,荧光抗体选择范围大。二、荧光染料的选择非特异结合有些荧光标记抗体表现出低水平的非特异结合,会造成阴性细胞的荧光水平升高。如(Cy3、Cy5和Cy5.5)和TexasRed标记的抗体,以及某些复合染料如ECD,与某些细胞结合力增强。颜色补偿荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波长范围;检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器被检测,从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可以通过“颜色补偿”校正这一干扰。单标管用于调补偿。二、荧光染料的选择Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmRelativeIntensityWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)ProteinFITC和PE荧光光谱补偿模型图补偿调节前后对比二、荧光染料的选择1.细胞表型分析双色分析:FITC与PE三色分析:双色分析+PE-CY5或PerCP-CY5.5。四色分析:三色分析+APC或PE-CY5。2.胞内蛋白与周期的关系分析蛋白标记:FITC或GFP,DNA标记:PI3.凋亡与坏死分析:凋亡用AnnexinV-FITC,坏死用PI。三、抗体选择选择商业化的流式用单克隆抗体,此类抗体非特异荧光弱。最好用直标抗体。样本来源:1、单细胞:外周血,细针穿刺,洗脱液等;2、组织:骨髓,肝,脾,淋巴结等;3、培养细胞:4、液体:血清、血浆、培养上清、细胞裂解液。四、样品制备及对照设置评价样品制备优劣的指标:1、细胞的密度高于1×106/ml;2、非特异荧光,不超过1%;3、无细胞碎片和聚集体,不能出现肉眼可见的团块。空白管:未染色细胞,调电压单染对照:单荧光素染色,调补偿同型对照:同型抗体,去除非特异性染色阴性对照:出现阴性结果阳性对照:出现阳性结果对照管和实验管:不加刺激因素和加刺激因素样品染色影响因素:体积,温度,时间。四、样品制备及对照设置细胞荧光有非特异性和特异性,实验结果有偶然性。设置对照至关重要。直接染色间接染色样品制备过程中常见的问题及解决对策常见问题原因解决对策细胞密度低细胞损失增加离心时间、弃上清非特异荧光强抗体不纯、死细胞多选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光碎片多细胞死亡、机械损伤细胞生长好、避免反复吹打细胞聚集消化不完全彻底消化荧光弱抗体少、反应时间短增加抗体量、延长反应时间五、数据分析处理WinMDI软件等。单参数直方图双参数二维点图等高图三维图设门:限定要分析的目的细胞群,FSCvsSSC点图是传统上用于设门的图;散点图中性粒细胞单核细胞淋巴细胞六、流式细胞仪的应用表型分析:淋巴细胞亚群:造血干/祖细胞:白血病和淋巴瘤的免疫分型:红细胞疾病诊断:细胞内蛋白检测:胞内细胞因子可溶性蛋白:CBA细胞功能检测:细胞周期、凋亡、DNA倍体分析肿瘤学:HLA-B27的检测:强直性脊柱炎细胞分选:(一)表型分析1、淋巴细胞亚群T细胞亚群:CD3+CD4+,CD3+CD8+调节性T细胞(Treg):CD4+CD25+B细胞亚群:CD19+CD5+,CD19+CD5-NK细胞:CD16+CD56+Th172、造血干细胞/祖细胞:造血干细胞表达CD343、白血病免疫分型:疫苗研发、免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、移植免疫检测等。淋巴细胞亚群检测淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高Th1/Th2细胞、造血干/祖细胞的检测CD34+造血干/祖细胞的检测,主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3、白血病免疫分型白血病和淋巴瘤的MIC分型:即形态(M)、免疫分型(I)、细胞遗传学(C)检测,免疫分型是重要的检测项目之一。FCM通过检测细胞表面或胞浆特异性的标记表达来对白血病进行免疫分型。(二)红细胞疾病诊断网织红细胞计数与应用网织红细胞是未成熟的红细胞,胞浆中残留有RNA,RNA含量越高,网织红细胞越幼稚。网织红细胞反映骨髓造血。用荧光染料噻唑橙(ThiazoleOrange,TO)染色网织红细胞中RNA,用488nm激光激发后发射绿色荧光,其荧光强度反映网织红细胞的RNA含量。用于贫血筛查。临床意义1、骨髓功能正常而网织红细胞增加,多见于内源性溶血性疾病,如镰状细胞溶血性贫血、地中海贫血等。2、网织红细胞正常或减少,多见于红细胞造血系统受损,病因是骨髓内红细胞成熟或生成异常,3、对病人的治疗管理:评估用药后病人的反应情况,监测骨髓移植过程,检测化疗和放疗对造血功能的损害。4、睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断,红细胞表面CD59缺失。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变,引起糖化肌醇脂(GPI)锚合成障碍,使GPI锚连蛋白缺乏,已证实的GPI锚连蛋白有10余种,用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种,如果在红细胞上出现CD55或/和CD59的减少,可诊断为PNH。(二)红细胞疾病诊断(三)细胞内蛋白检测细胞内细胞因子染色(ICS):标本(PBMC)刺激剂+抑制细胞因子分泌[BFA或莫能菌素(Monensin)]固定(多聚甲醛)打孔(破膜剂)荧光标记:IFN-γ-FITC,IL-4-PE,CD3-Pro-CP,CD8-APC。CBA(CytometricBeadArray,微球阵列法),同时检测多种因子(最多可同时检测8种)。(四)可溶性蛋白CBA技术与传统的ELISA相比有下列优点:1、CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。2、CBA所需样本仅为ELISA所需样本量的1/6。3、CBA的灵敏度与ELISA相当,但稳定性更好。4、对混合物做一次流式检测,可得到多种指标的数据。5、能避免由于酶联放大技术使信号失真导致的假象。6、CBA实验时间比单次ELISA大大缩短。捕获微球捕获抗体+CBA技术检测胞外细胞因子+待分析的产物荧光检测抗体CBA0pg/mL80pg/mL1250pg/mL5000pg/mL(五)细胞功能检测1、细胞DNA分析:细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤诊断2、细胞凋亡:荧光染料如PI(Propidiumiodide,碘化丙啶)与细胞内DNA碱基结合,被染色的细胞在激光照射下发射出荧光,荧光强度与DNA含量成正比。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测等。1、细胞DNA分析细胞周期与DNA分析4NM期:细胞分裂期4NG2期:DNA合成后期2N-4NS期:DNA合成期2NG1期:DNA合成前期2NG0期:DNA合成静止期DNA倍体细胞周期:细胞周期与DNA的倍体关系02004006008001000PIFluorescenceCounts0751502253002N4N细胞周期与DNA的倍体关系DNA的倍体和DNA指数的关系DNA倍体DNA指数(DI)意义(染色体数)正二倍体(2n,Diploid)1.0046条染色体亚二倍体(Haploid)0.5023条染色体四倍体(Teraploid)2.0092条染色体低倍体(Hypoploid)1.046条染色体高倍体(Hyperploid)1.046条染色体正常细胞DNA指数为1.00,DNA指数>1,为超2倍体,<1为亚2倍体,两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志,实体肿瘤中出现频率较高。DI=样品G0/1细胞峰均道值正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值DNA指数02004006008001000PIFluorescenceCounts075150225300非整倍峰DNAindex1.21DNA的倍体和DNA指数的关系DNA与凋亡(1)FCM-DNA检测(DNA亚G1峰的检测);(2)“TUNEL”法;(3)Annexin-V-FITC/PI双染法;(1)FCM-DNA检测原理:凋亡细胞内核酸酶释放,将
本文标题:流式细胞术
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