动物细胞大规模培养

第十一章动物细胞大规模培养教学内容1、动物细胞培养基2、动物细胞培养方法3、动物细胞培养生物反应器4、动物细胞培养技术5、动物细胞大规模培养工艺第十一章动物细胞的大规模培养本章内容提要在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，如表11-1所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产品。大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别列举出2-3个产物。问题表11-1动物细胞培养的产物疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等补充内容（一）单克隆抗体哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。抗体由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。抗原指诱导产生抗体的物质。如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入抗体2抗体1于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。多克隆抗体在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。补充内容（二）动物细胞培养步骤培养动物细胞一般可按以下步骤进行：无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养一、动物细胞培养基1、动物细胞培养的环境动物细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各种环境因素的影响。为了使动物细胞的培养处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的，影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有温度、PH值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。温度细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，例如昆虫细胞的最适温度是25-28℃，人和哺乳动物的细胞的最适温度是37℃.细胞代谢强度与温度成正比，高于最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。总的来说，动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如温度升至45℃时，1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低细胞置于25-35℃时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死，甚至于放在4℃，数小时后再置于37℃培养，细胞仍能继续生长。PH值合适的PH值是细胞生存的必要的条件之一。动物细胞合适的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对PH值也有不同的要求，原代培养细胞对PH值的变化耐受性差，传代细胞对PH值变化的耐受性较强。而对于同一种细胞，增长期和维持期的最适PH也不尽相同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。营养成分细胞的生长、繁殖以及产物的合成都必须从环境中摄取各种营养物质，以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子等。溶氧及气体环境（P205）渗透压等其它因素（P205）1、影响动物细胞生长、繁殖的环境因素有哪些？问题2、动物细胞培养合适的PH值为多少？2、培养基的组成培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，其优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类有很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。3、溶氧浓度过高过低对细胞生长有何影响？4、细胞代谢产物CO2对细胞生长有何作用？1、天然培养基有哪些？它有何优缺点？问题2、血清和血浆分别如何取得？血液组成：红细胞、白细胞、血小板和血浆。高速离心，分三层：上层为血浆40%多。血浆冷冻到-30度，离心，分层：上层为血清，下层为杂蛋白（少）。3、最广泛使用的血清是什么动物血清？它有何营养成分？血浆组织浸出液血清组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，这是因为血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。用于组织细胞培养的血清的种类很多，其来源主要动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供给细胞生物匠营养物质，但由于血浆很容易发生液人经，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。水解乳蛋白水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制成0.5%的溶液，或与合成培养基以1：1共同使用。合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基所无法比拟的优点，它既能经细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。目前所有的细胞培养都已采用经标准化生产、组成和含量都相对固定的各种合成培养基，并已有配制好的干粉型商品。尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。合成培养基中一般都有哪些营养成分？问题3、常用的合成培养基目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199培养液、Eagle(MEM、DMEM)培养液、RPMI1640培养液、HAM培养液等。表11-2为常用的培养基的成分和配方。1、目前较常用的合成培养基有哪些？问题2、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？3、无血清培养液由哪两部分组成？P208表11-4微生物细胞和动物细胞性质的比较性质微生物细胞动物细胞大小1-10μm10-100μm代谢调节方式内部内部和激素营养要求宽松，可利用多种底物苛刻生长速率倍增时间一般为0.5-2h倍增时间一般为12-60h机械强度较好很差，缺乏保护性细胞壁环境适应好差二、动物细胞培养方法所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。表11-4，表11-5是微生物细胞与动物细胞性质和培养方法的比较。表11-5微生物和动物细胞培养方法的比较微生物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时—几天几天—3、4周对水纯度的要求较低很高与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。1、悬浮培养P2091、动物细胞培养有哪三种类型？提问1、悬浮培养是用培养哪一类细胞的？问题2、悬浮培养有何优缺点？2、贴壁培养贴壁指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养培养，主要用于非淋巴组织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。在贴壁培养依赖性细胞中，请比较滚瓶培养系统和微载体培养系统？问题细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。图11-1为细胞在培养表面贴壁过程示意图。3、固定化培养固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。三、动物细胞培养生物反应器自70年代以来，用于动物细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模也越来越大。根据生物反应器的不同用途，有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用生物反应器等，其种类大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式通气搅拌反应器、双层笼式通气搅拌反应器、空气提升式反应器等。1、气升式细胞培养生物反应器气升式反应器的基本原理如图11-2所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量