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外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能孔芹，方浩，夏黎明（浙江大学生物质化工教育部重点实验室，化学工程与生物工程学系,浙江，杭州310027）摘要：外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一，提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。本文分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法，对已有的基因重组转化子进行筛选试验，获得了6个优良转化子，其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验，获得了外切-β-葡聚糖酶（C1）高产转化子TrichodermareeseiZU-101,液体培养48h，其C1酶活力可达18.24U·mL-1，是出发菌株的2.16倍；分析结果表明：重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大，但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高，纤维素酶的总活力（滤纸酶活力FPA）也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验，当酶用量为20FPIU·g-1底物，水解48h，重组转化子T.reeseiZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。关键词：重组里氏木霉；外切-β-葡聚糖酶；转化子筛选；玉米秸秆；酶水解中图分类号：TQ920文献标志码：A文章编号：0438-1157（2013）00-0000-00ScreeningandcellulaseproductionofrecombinantTrichodermareeseiwithhighactivityexo-β-glucanasesKONGQin,FANGHao,XIALi-ming(KeyLaborotaryofBiomassChemicalEngineeringofMinistryofEducation,DepartmentofChemicalEngineeringandBioengineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,Zhejiang,China)Abstract:Increasingtheactivitiesofexo-β-glucanases,oneoftheimportantcomponentsofcellulase,isakeytostrengtheningthesynergisticdegradationofcellulaseandreducingthecostofcellulolytichydrolysis.ThemethodsofMCC-agarplatescreeningandliquidculturemediumoffilterpaperwereusedinthisworkrespectivelytoscreenTrichodermareeseitransformants,obtaining6superiortransformantswithhigherfilterpapercollapsingrateandgrowingrateonMCC-agarplates.Furtherscreeningexperimentwasconductedundershakingflaskcondition,obtiningthehighlyxo-β-glucanase(C1)-producingtransformantT.reeseiZU-101whoseC1activitywas18.24U·mL-1after48hliquidculture,2.16-foldhigherthantheoriginalstrain.Analysisresultsdemonstratedthatfilterpaperactivity(FPA)ofthecellulasesystemofthetransformant,representingtotalactivity,increasedby61.9%asexo-β-glucanaseactivityascendedsignificantly,althoughendo-β-glucanaseandcellobiaseactivitiesvariedinsignificantlyfromtheoriginalstrain.TheenzymatichydrolysisyieldofT.reeseiZU-101’scellulaseinthehydrolysisofalkalipretreatedcornstoverwas94.4%whentheenzymedosageandhydrolysistimewere20FPIU·g-1substrateand48h,respectively.Theresultsofthepresentworkhavepromisingapplicationprospectsinthebioconversionandutilizationofrenewablecellulosicmaterials.Keywords:recombinantTrichodermareesei;exo-β-glucanases;screeningoftransformants;cornstover;enzymatichydrolysis引 言 2013-00-00收到初稿，2013-00-00收到修改稿。 联系人：夏黎明。第一作者：孔芹（1988—），女，硕士研究生。 基金项目：浙江省重点科技创新团队计划资助（2011R50002）。Receiveddate:2013-00-00.纤维素是一种由D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键结合而成的葡聚糖大分子链，作为植物细胞壁的重 Correspondingauthor:Prof.XIALiming,xialm@zju.edu.cnFoundationitem:SupportedbytheProgramforZhejiangLeadingTeamofS&TInnovation(2011R50002) 2014-01-1515:23要成分，是世界上最丰富、最廉价且未得到充分利用的可再生性资源。纤维素生物质如农林业废弃物和部分城市工业废物经酶解糖化生产乙醇等生物能和其他生物基制产品，对于解决粮食短缺、能源危机和环境污染等问题意义重大[1-3]。纤维素资源的生物炼制需经过三个基本步骤：粉碎、预处理、酶水解[4,5],提高纤维素酶对纤维素原料的水解效率是降低成本提高经济效益的关键技术之一[6]。纤维素酶是多组分的复合酶，包含三类主要成分：内切-β-葡聚糖酶（亦称CMC酶）、外切-β-葡聚糖酶（亦称C1酶、纤维二糖水解酶）、β-葡萄糖苷酶（亦称纤维二糖酶、CB）[7]。纤维素酶在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠不同组分之间的协同作用才能完成[8]。目前常见的商品纤维素酶主要适用牛仔服等棉织品的水洗整理，以内切-β-葡聚糖酶为主[9、10]。而玉米秸秆等植物纤维原料的降解除需要高活力的内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶以外，还需要高活力的外切-β-葡聚糖酶。采用基因工程技术，对纤维素酶生产菌株进行定向进化，提高纤维素酶系组成中外切-β-葡聚糖酶的比例，已经取得重要进展[11、12]。本文在前期研究工作的基础上，对实验室已有的基因重组转化子进行一系列筛选工作，并对优良重组转化子的产酶性能以及重组纤维素酶的水解性能进行研究，旨在获得高活力外切-β-葡聚糖酶以及高协同降解性能的纤维素酶生产菌株，对可再生纤维素资源的生物转化与利用具有重要的作用。1材料与方法1.1菌株来源里氏木霉（Trichodermareesei）重组转化子，由本实验室采用基因工程技术构建而成[12]，经过潮霉素平板筛选后，于4℃冰箱中保存。1.2培养基1）微晶纤维素（MCC）琼脂筛选培养基：磷酸二氢钾2.0g；硫酸铵1.4g；硫酸镁0.3g；氯化钙0.3g；硫酸亚铁5.0mg；硫酸锰1.6mg；氯化锌1.7mg；氯化钴2.0mg；琼脂15g；微晶纤维素20g；水1000mL；pH4.8。2）滤纸崩解培养基：氯化钙0.1g；硝酸钠2.5g；磷酸氢二钾1.0g；硫酸镁0.3g；氯化钠0.1g；硫酸亚铁0.01g；水1000mL；滤纸（0.5x3cm）；pH4.8。3）种子培养基（%）：葡萄糖1.0；玉米浆粉0.9；硫酸铵0.5；硫酸镁0.1；氯化钙0.05；磷酸二氢钾1.0；微量元素0.1。4）发酵培养基（%）：乳糖1.8；微晶纤维素2.0；玉米浆粉1.2；硫酸铵0.5；硫酸镁0.1；氯化钙0.05；磷酸二氢钾0.6；微量元素0.1；麸皮0.2；吐温800.02；碳酸钙0.18。1.3筛选方法1.3.1微晶纤维素（MCC）琼脂平板法所有转化子五个或六个为一组，用切割器在转化子菌落边缘切取直径为3mm的菌块，每个转化子取3块，分别转移到MCC筛选平板上，30℃恒温培养，定时观察记录每个菌落的生长直径，并计算每个转化子菌落生长直径的平均值dm。1.3.2滤纸崩解法用接种针将初筛转化子转移到50mL（250mL三角瓶）种子培养基中，于31℃、200r·min-1下，培养48h制成液体菌种。按10%的接种量将种子液加到20mL（50mL三角瓶）滤纸液体培养基中，30℃、170r·min-1摇床培养。每个转化子做3个重复平行样，定时观察记录液体培养基中滤纸的崩解情况。1.4摇瓶产酶试验将筛选到的转化子菌株接种到50mL（250mL三角瓶）种子培养基中，于31℃、200r·min-1下培养48h。然后按10%的接种量将种子液加到50mL（250mL三角瓶）发酵培养基中,30℃、200r·min-1下进行产酶实验。定时取样，离心取上清液检测纤维素酶活力。1.5纤维素酶活力的测定1.5.1外切-β-葡聚糖酶（C1酶）活力测定10mL试管中，加入0.02g微晶纤维素底物、1.0mL柠檬酸缓冲溶液（0.05M、pH4.8）和0.5mL适当稀释的酶液，50℃水浴中反应30min，离心，DNS法[13]测上清液中的还原糖。将上述条件下每小时由底物产生1.0mg还原糖所需的酶量定义为一个单位，用U·mL-1表示。1.5.2滤纸酶活力（FPA）测定根据国际理论应用化学协会（IUPAC）推荐的国际标准方法测定[14]，DNS法[13]测还原糖。酶水解反应中每分钟由滤纸生成1.0µmol葡萄糖的酶量定义为一个FPA国际单位，以IU·mL-1表示。1.5.3内切-β-葡聚糖酶（CMC酶）活力测定10mL试管中，加入1.0mL柠檬酸缓冲溶液（0.05M、pH4.8）配制的1%羧甲基纤维素钠，加入适当稀释的纤维素酶液，50℃水浴中反应30min，DNS法[13]测上清液中的还原糖。每小时由底物产生1.0mg还原糖所需的酶量为一个活力单位，以U·mL-1表示。1.5.4纤维二糖酶(CB酶)活力测定10mL试管中，加入1.0mL纤维二糖溶液（0.5%、pH4.8）、0.05mL适当稀释的纤维素酶液，再加入0.95mL柠檬酸缓冲液（0.05M、pH4.8），50℃水浴中反应15min，反应结束后葡萄糖氧化酶法测定生成的葡萄糖。每分钟生成2.0µmol葡萄糖的酶量定义为一个单位，以IU·mL-1表示。1.6玉米秸秆的酶解酶解底物为2%氢氧化钠溶液预处理[15]后的玉米秸秆残渣，其中纤维素和半纤维素含量分别是物料干重的64.1%和24.6%。玉米秸秆残渣底物浓度为100g