LightCycler480荧光定量PCR技术原理-相对定量HRM

1RocheAppliedScience1LightCycler480荧光定量PCR技术原理罗氏诊断产品（上海）有限公司主要内容普通PCR与荧光定量PCR区别荧光定量PCR的检测模式荧光定量PCR技术平台的功能开发2RocheAppliedScience3在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线实时荧光定量PCR技术典型PCR扩增曲线RocheAppliedScience4把PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值的缺省设置是3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍荧光阈值3RocheAppliedScience5)+1log(log)log(+)+1log(log=XSBTXOTERRREXC--n=lg(Rn－RB/RsX0)/(1+E)当循环次数n=CT值时：即CT=-klgX0+b(线性方程，CT和起始模板浓度成反比)Rn=RB+X0(1+E)nRs总信号=本底信号+分子数量单位信号强度定量的理论基础检测信号理论方程RocheAppliedScience6每个反应管内的荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，即从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多Ct值越小•浓度每增加10倍，CT值减小3.3个单位CT值(cyclethreshold)/Cp值(crossingpoint)4RocheAppliedScience7qPCR定量前提：Cp值具高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。RocheAppliedScience8荧光定量PCR普通PCR不仅可以相对定量，还可以绝对定量绝对和相对定量困难(相对于看家基因的定量复杂)有效鉴别非特异扩增和突变副产物形成不能鉴别动力学范围广(100～1010拷贝/mL)动力学范围有限实时监测荧光信号检测模式为电泳在PCR反应的对数期检测，分析起始点产物的量在PCR反应的平台期检测，分析终点产物的量两者区别5RocheAppliedScience9主要内容普通PCR与荧光定量PCR区别荧光定量PCR的检测模式荧光定量PCR技术平台的功能开发RocheAppliedScience10荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法••非特异性染料非特异性染料SYBRGreenSYBRGreenI••序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqmanMolecularBeaconsMolecularBeaconsHybHybProbesProbesSimpleProbeSimpleProbeUniversalprobeUniversalprobe6RocheAppliedScience115’3’5’3’ExcitationSGEmission染料检测-SYBRGreenISGSGSGSGRocheAppliedScience125’3’5’3’ExcitationEmissionSGSGSGSGSG染料检测-SYBRGreenI7RocheAppliedScience13序列特异性探针检测-水解探针RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationRocheAppliedScience14Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer杂交探针（HybProbe）8RocheAppliedScience15RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标（MolecularBeaconProbe）RocheAppliedScience16各种检测方法的特点SYBRGreenI染料法：通用性好，灵敏度高，只要在普通PCR反应体系中加入荧光染料，稍优化即可，可通过做熔解曲线来分析扩增产物；特异性差，模板起始浓度不同，本底信号也不同，适合进行定性、定量检测。HybProbe探针：特异性好，扩增效率高，并且可通过做熔解曲线来分析突变和基因分型；通用性不好。适合定性、定量以及熔解曲线法基因分型。TaqMan探针：特异性好，不能做熔解曲线分析；通用性不好，扩增效率因水解作用受影响，信号的产生不依赖于特定的温度，5‘-3’外切酶活力难测定。适合定性、定量分析，也可以进行终点法基因分型。9RocheAppliedScience17*andotherintercalatingdyebasedassaysProbebasedassaysSYBRGreenI*´SpecificityorFlexibility?SpecificityFlexibility如何兼具通用性和特异性？RocheAppliedScience18UniversalProbeLibrary通用探针库技术要点把传统的水解探针由25-35nt减至8-9nt，报告基团用Fluorescein标记，并使用了低背景的BHQ（Blackholequencher）淬灭基团熔解温度取决于所用的LNA（lockednucleicacidtechnology，锁定核苷酸）技术——核苷的2、4位形成环氧亚甲基桥结构，提高短探针Tm值，使其Tm值高于引物达到qPCR的要求。其检测特异性由引物和探针共同来决定。通过网络设计中心如何体现通用性？针对人类、大鼠、小鼠、灵长类动物、果蝇、线虫、拟南芥、玉米等模式生物，用生物信息学方法筛选出165条出现频率最高的8-9mer序列每个转录本可以与多条探针匹配,每个探针可覆盖人的7,000个转录本该探针库可以用于LightCycler系列仪器，也可以用于其它荧光PCR仪器，并且可以跟FastStartTaqMan®ProbeMaster试剂配套使用。RocheAppliedScience20165条特异探针可以定量检测7种生物体的几乎所有转录本11RocheAppliedScience21针对特定代谢途径相关基因或特定基因家族进行表达水平筛查ApoptosisPanelCellCycleRegulationPanelGPCRPanelABCTransporterPanelNuclearReceptorPanel内含：特异探针（UPL）、引物及阳性对照相关看家基因探针及引物RocheAppliedScience22主要内容普通PCR与荧光定量PCR区别荧光定量PCR的检测模式荧光定量PCR技术平台的功能开发定性分析绝对定量相对定量TmCalling等位基因分型(SNP分析)基因扫描未标记探针在基因分型中的应用12RocheAppliedScience23QualitativeAnalysis－定性分析基于靶序列扩增产物的有无对未知样品进行定性分析。也可以引入质控进行定性分析：内部质控（InternalControl）:在同一个毛细管利用双色反应确认反应正常。运行质控（RunControls）:利用阳性和阴性对照确认实验设置。任何一个质控失败的结果都是无效的。RocheAppliedScience24实时定量PCR定量原理绝对定量相对定量外部标准曲线(单色)外部标准曲线(无校准样本)校准样本归一化方法无效率校正有效率校正外部标准曲线带内对照(双色)定量分析原理13RocheAppliedScience25绝对定量的应用病毒和病原菌定量分析转基因动植物转基因拷贝数的检测GMO定量检测RocheAppliedScience26绝对定量原理（使用标准品进行绝对定量）标准曲线(外标准或内标准)未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)log(F2/F1)log(F2/F1)RocheMolecularBiochemicalsDiagnosticsLightCycler的定量原理标准曲线(外标准或内标准)未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3814RocheAppliedScience27序列:尽可能与目的基因序列相同（同样的扩增子/GC含量）以保证扩增效率相同。来源:-PCR:质粒DNA(最好线状)纯化的PCR产物ReferenceDNA(genomicDNA)-一步法RT-PCR:体外转录RNAReferenceRNA(totalRNA,mRNA)绝对定量－标准品的准备RocheAppliedScience28绝对定量－标准曲线制作使用3-5个标准品对于中等浓度和高浓度，每个稀释度需要一个位点对于在一个局限的检测范围内的定量，使用两次重复甚至三次重复制备标准曲线时，使用的稀释系列最好每个梯度选一个点(e.g.,1:10,1:100,1:1000,...)15RocheAppliedScience2929LightCycler®480使用最大二阶导数法自动计算Cp值标准曲线选项:-采取同一次实验时的标准品-导入之前保存的标准曲线外标法绝对定量最大二阶导数法分析RocheAppliedScience3030LightCycler®480FitPoints法:使用者自行调节曲线噪音后计算得到Cp值标准曲线选项:-采取同一次实验时的标准品-导入之前保存的标准曲线外标法绝对定量FitPoints法分析16RocheAppliedScience31•先决条件标准品浓度已知外标准品与样品有相同的PCR-扩增效率绝对定量（标准曲线）－SummaryRocheAppliedScience32实时定量PCR定量原理绝对定量相对定量外部标准曲线(单色)外部标准曲线(无校准样本)校准样本归一化方法无效率校正有效率校正外部标准曲线带内对照(双色)定量分析原理17RocheAppliedScience33相对定量分析的必要性绝对定量分析的前提不能同时得到满足SampleBSampleBSampleASampleA目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同RNARNA提取效率相同提取效率相同细胞起始数相同细胞起始数相同RocheAppliedScience34FluorescenceCycles参考序列FluorescenceCycles目标序列未知样本结果=目标基因浓度内参基因浓度CyclesFluorescence标准曲线标准曲线CyclesFluorescenceCrossingPointLogConcentrationCrossingPointLogConcentration相对定量用外标法进行相对定量同一样品中目标基因表达的浓度与看家基因表达的浓度相关；校正了样品间质量和数量的差异。18RocheAppliedScience35相对定量Step1:相同样品中的目标基因和参比基因的浓度Step2:不同样品中目的基因的含量差别由参比基因校正参比基因可以修正不同样品中：起始量的差别核酸回收率及质量的差别可能的RNA降解加样差T=100T=10T=10=2=2=0.2R=50R=5R=50=calibratortreatedcell2（目标基因浓度）（参比基因浓度）RocheAppliedScience36参比基因的选择理想