第八章基因重组与基因分析ppt-PowerPoint

南京农业大学生命科学学院生物化学技术原理及应用第八章基因重组与基因分析2019/9/13南京农业大学生命科学学院22019/9/132南京农业大学生命科学学院核酸的分离纯化检测1DNA的体外合成2核酸序列测定3分子杂交4基因重组与表达5第一节核酸的分离纯化检测核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化，核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，要纯化核酸就必须去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，同时要保持所要提取核酸分子的结构和活性不被破坏。核酸的性质：DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。2019/9/133南京农业大学生命科学学院第一节核酸的分离纯化检测1.核酸分离、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。分离核酸原则：温度不要过高；控制一定的pH值范围（pH值5-9）；保持一定的离子强度；减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。2019/9/134南京农业大学生命科学学院第一节核酸的分离纯化检测1.核酸分离、纯化原则保持防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。DNA酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羟基喹啉；阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。2019/9/135南京农业大学生命科学学院保持防止核酸的生物降解RNA酶抑制剂。RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。皂土。皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC（二乙基焦碳酸盐）。粘性液体，强核酸酶抑制剂作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：①DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。②容易降解，保存在4℃或液氮中；③提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。④剧毒。其它：肝素、复合硅酸盐、RNase阻抑蛋白、氧钒核糖核苷复合物。2019/9/13南京农业大学生命科学学院6第一节核酸的分离纯化检测2.核酸提取的过程与原理核酸提取的主要步骤为：裂解细胞。去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。浓缩沉淀核酸。纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质。检测纯度与质量。核酸的保存保存。2019/9/137南京农业大学生命科学学院2.核酸提取的过程与原理细胞的破碎细胞破碎的方法有：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法（SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。该过程要在低温下进行，并避免核酸酶对核酸的水解。核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种，针对所提核酸的种类，要选择合适的方法。2019/9/13南京农业大学生命科学学院8核蛋白的解聚、变性蛋白的去除常用方法：加入浓盐溶液（如NaCl）。核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；酚/氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离（酚:氯:异戊醉=25:24:1）。2019/9/13南京农业大学生命科学学院9核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度小（仅为水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)核酸的沉淀浓缩核酸和蛋白质分离后，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯仿。接下来要浓缩核酸，沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀的具体方法见第二章。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。核酸的纯化得到核酸沉淀后，还要要去除盐类，有机剂等杂质。通常是用乙醇洗涤，由于乙醇易挥发，最后只剩下比较纯的核酸。2019/9/13南京农业大学生命科学学院10核酸的浓度与纯度的测定A.紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40μg/ml。测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。2019/9/13南京农业大学生命科学学院11核酸的浓度与纯度的测定A.紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量测RNA纯RNA样品其OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。若RNA样品OD260/OD280比值太小，有蛋白质或酚污染；比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。B.溴乙锭荧光法测定核酸的含量如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。此法的比较主要基于目测，是估计水平。C.电泳检测核酸的含量和质量通过电泳，可以观察所得核酸样品降解情况，也可以通过与标准Marker亮度比较来估计所得核酸含量。2019/9/13南京农业大学生命科学学院12核酸的保存DNADNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；长期保存样品中可加入一滴氯仿。RNARNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存；长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。2019/9/13南京农业大学生命科学学院13第一节核酸的分离纯化检测3.植物总DNA的提取（CTAB法）操作步骤：取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。将1mL研磨液转入1.5mL离心管中，置于65℃水浴中保温20min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞12000r/min离心5min，取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心5min。抽提去蛋白将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600µL异丙醇。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于20µLTE缓冲液待测。2019/9/1314南京农业大学生命科学学院3.植物总DNA的提取注意事项：选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇，尽可能选取幼嫩的材料；收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；2019/9/13南京农业大学生命科学学院15为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。可加少量Rnase降解RNA。第一节核酸的分离纯化检测4.细菌质粒DNA的提取细菌质粒染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常编码一些对宿主有利酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等。常用作基因重组的载体。质粒提取要去除的物质：蛋白、基因组DNA、脂类及小分子杂质、RNA。常用的方法有碱裂解法、煮沸裂解等。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA。2019/9/1316南京农业大学生命科学学院第一节核酸的分离纯化检测4.细菌质粒DNA的提取（碱裂解法）碱裂解法的原理：碱裂解法主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。2019/9/1317南京农业大学生命科学学院4.细菌质粒DNA的提取所用试剂：溶液I。作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II。作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III。作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白——SDS与线性DNA沉淀，K＋可中和DNA酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA2019/9/13南京农业大学生命科学学院184.细菌质粒DNA的提取所用试剂：溶液I。作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II。作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III。作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白——SDS与线性DNA沉淀，K＋可中和DNA酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA2019/9/13南京农业大学生命科学学院194.细菌质粒DNA的提取提取步骤：取1.5ml培养物倒入eppendorf管中，12000r/min，4℃离心30秒。弃上清，将管倒置于吸水纸上使液体流尽。将细菌沉淀悬浮于100μl溶液I中，室温下放置5-10分钟。加200μL溶液II（新鲜配制），盖