第六章DNA的重组与转座4

第六章DNA的重组与转座重组和突变是产生遗传变异的两大主要因素，但二者的分子机制截然不同：重组是已经存在的遗传信息发生重排，而突变是改变基因组中的碱基。但二者在分子机制上又是相互影响的。一概念DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称为DNA的重组(遗传重组或基因重排)。第一节DNA的重组二DNA重组的意义对生物进化起着关键作用。能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)，使有利突变与不利突变分开，通过优化组合积累有意义的遗传信息；提供修复机制；调节基因表达等。三重组主要类型1同源重组2特异位点重组3异常重组其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同。1同源重组◎发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。◎Holliday重组模型RobinHolliday于1964年提出了重组的杂合DNA模型，又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下：同源的非姐妹染色单体联会；同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；切开的单链交换重接;形成交联桥结构；交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）绕交联桥旋转180度；形成Holliday异构体；通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。(1)5’AB3’(8)A3’5’B3’5’5’ab3’两臂旋转联会(2)5’AB3’b3’5’a3’5’5’ab3’(9)A酶切B(3)5’AB3’3’5’b3’5’a5’ab3’游离端移动联会(4)5’AB3’(10)AA3’5’BB3’5’5’ab3’游离端交叉连接bb(5)5’AB3’aa3’5’3’5’(11)ABAb5’ab3形成单链交叉abaB(6)5’AB3’3’5’3’5ABAb5’ab3’分支点移动(7)AabaBBab图23－8Holiday重组模型。片段重组体拼接重组体无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，他们都含有一个异源双链DNA区。◎异源双链与基因转变异源双链DNA：由不同亲本双链分子中的互补单链产生碱基配对的双链DNA，在遗传重组中产生。基因转变：一个基因转变为它的等位基因的遗传学现象。基因转变的实质：重组过程中留下的局部异源双链区，在细胞内的修复系统识别下不同的酶切/不酶切产生的结果。不同的切除会产生不同的结果。×◎细菌的基因转移与重组机制细菌接合：指通过细菌细胞的直接接触，遗传信息从供体单向转移到受体的过程。致育因子：能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子。简称性因子或F因子。转化(transformation)：指细菌品系吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状改变的现象。具有摄取环境中游离DNA分子能力的细菌称为感受态细胞(competentcell)。有些细菌在自然条件下就可成为感受态；在实验室也可用高浓度Ca2+诱导细菌成为感受态。×转导作用:当病毒从被感染的供体细胞释放出来﹑再次感染另一细胞时,发生在供体细胞和受体细胞之间的DNA转移及基因重组.整合细菌的融合(transduction)：细菌细胞膜融合导致的基因转移和重组叫细胞融合。×◎同源重组的酶学机制DNA分子之间的交换仅涉及DNA分子重组机制和限制区域的这一部分，而不是整个染色体。有三种情况:由断裂分子产生的单链与非姊妹染色单体的双链相互作用；单链侵入双链异源双链结构的形成。以上每一步都需要酶的催化Chi位点和RecBCD核酸酶(外切酶)Chi位点：它由于单个碱基对的改变产生了刺激重组的位点。这一位点是由8个碱基组成的非对称序列：5′GCTGGTGG3′3′CGACCACC5′●由断裂分子产生的单链与非姊妹染色单体的双链相互作用Chi序列天然存在于大肠杆菌的DNA中,每5-10kb长的序列出现一次.Chi位点是recBCD编码的RecBCD核酸酶的靶序列RecBCD酶是一种强的核酸酶，可降解DNA，具有解旋酶活性，在SSB存在时它可以解开双链；具有ATPase活性。在重组中的作用是提供带有游离端的单链区。当RecBCD结合在DNAChi位点右侧的短裂端时，它沿着DNA移动，使DNA解旋。当到达Chi位点3′端4-6pb时它停顿下来，并切开单链DNA,产生具有3′端的游离单链.引发异源双链的形成.Chi位点的识别导致RecBCD核酸酶失去的活性，但继续发挥其解旋酶的作用。RceA蛋白有两个主要功能：诱发SOS反应；促进DNA单链的同化,即单链与同源双链发生链的交换。RecA能使单链DNA取代双链分子中同源的链，一般要具备三个条件：①其中一个DNA分子必须要有一个单链区域；②其中一个DNA分子必须要有一个游离的3′末端；③此单链区域和3′末端必须和另一个DNA分子有互补区。●单链侵入双链RecA蛋白与Holliday中间体的形成RecA蛋白与单链DNA结合；复合物与同源双链DNA结合；入侵单链与双链中互补链配对，同源链被转换出来RuvA和RuvB蛋白可促进异源双链结构的形成。RuvA可识别Holliday连接的结构,形成一个四面构象,促进分支点移动；RuvB是一种解旋酶，它可发动迁移反应。RuvC将Holliday中间体切开,由DNA聚合酶和连接酶修复合成.●异源双链结构的形成Ruv蛋白和Holliday中间体的拆分大肠杆菌中涉及产生重组DNA的重组基因基因功能RecBCD系统具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3ˊ游离未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依赖的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它与双链断口结合，解开DNA并导入裂口，其倾向性位点称为chi(参见重组热点)。RecBCD酶产生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性;(2)在单链DNA和ATP存在的条件下RecA能启动DNA单链和与之互补的双链分子进行碱基配对。RceG具有解旋酶活性，可解离Hollidy连接RuvAB系统具有解离Hollidy连接的活性RuvA可识别Holliday连接的结构RuvB是一种ATPase，它可发动迁移反应RuvC具有内切酶活性，可特异识别Hollidy分枝，它在体外可切这个连接体，解离重组中间体2特异位点重组概念：指发生在一个特定的短DNA序列内由特异的酶和辅助因子识别和作用的重组。λ噬菌体DNA进入大肠杆菌后存在溶源(CⅠ占优势)和裂解(Cro占优势)两条途经，二者都要求早期基因的表达。噬菌体的附着位点:attP细菌的附着位点：attBλ噬菌体整合酶：Intλ噬菌体编码蛋白：Xis细菌的宿主整合因子：IHF◎λ噬菌体DNA的整合与切除◎细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表达的互变，称为鞭毛相转变，这种转变是由H片段倒位决定的，此倒位是由于特异重组位点hix发生重组后引起的。特异重组位点hix发生重组后，引起H片段倒位，使H2鞭毛蛋白不表达，H1表达。◎基本概念转座子（transposon):是在基因组中可移动的一段ＤＮＡ序列。转座：转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程叫转座。转座过程有5大特点：转移、不独立、与转座基因共存、随机、引起基因产物改变。3转座子重组(异常重组)◎转座子的分类插入序列IS复合转座子1同源重组2特异位点重组3异常重组插入序列(IS)IS是基因组中可移动遗传因子家族中的成员之一，它可以整合到宿主非同源位点上，若IS插入到某基因内，通常这个基因就会失活。图23-18质粒上有IS，那么经变性和复性后，在电镜下可以观察到茎环结构的存在(引自Griffithsetal1999)IS因子特点只含有与转座有关的酶基因，不含抗药性及其它基因，两端有15-25bp反向重复序列(IR)。类插入序列（IS-likeelements）是指IS10R，IR50R和IS903，它们的结构和IS相似，但不独立存在。而是作为复合转座子两臂的组件。表IS的结构和功能DR(bp)IR(bp)中心区域(bp)靶的选择拷贝数插入序列:IS1923768随机5～8IS25411327热点5(在F因子上为一)IS411~13181428AAN20TTT1或2IS54161195热点？类插入序列:IS10R9221329NGCTNAGCNIS50R991531热点IS9039181057随机ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT反向重复区靶序列顺式重复区转座子转座子在靶位置插入前后的结构复合型转座子(Tn)这类转座子中除了转座酶基因外，还有药物抗性基因，结构较大而复杂，故称为复合转座子。有Ⅰ和Ⅱ两种类型。Ⅰ型：两末端有相同的IS序列，或正向，或反向。Ⅱ型：末端有38bp的反向重复序列。图两种不同的转座子含有不同的IR区域和不同的抗性基因。(a)Tn9含有一个短的IR区。因两个IS1元件以相同的方向排列，每个元件都有一个IR序列(b)Tn10含有一个长的IR区。两个IS成分方向相反(引自Griffithsetal1999)转座因子长度(bp)遗传标记末端组件方向Tn9033100KanRIS903反向Tn92500CamRIS1正向Tn109300TetRIS10RIS10L反向Tn55700KanRIS50RIS50L反向表复合转座子的结构◎转座子的转座机制自学转座子插入到DNA上新的位点，首先交错切开靶DNA，再将转座子连接到靶的凸出单链上，最后填补空缺完成转座。按在转座过程中是否发生复制，可以分为：复制型转座非复制型转座1979年Shapiro提出了转座模型这个过程开始是形成单链转移复合体[有时也称为交换复合体]，供体和靶的单链连接，这样转座子的两个末端分别与靶及供体单链相连接。连接转移复合体产生了一个交换形成的结构在双链转座子处结合在一起，这个交换结构（即共同中间体）决定了转座方式的命运。交换结构的每个交错末端含有一个单链区。这个区域是个假的复制叉。它提供了DNA合成的模板。若复制继续，那么它的延伸将经过转座子，将它的链分开，在其末端终止复制，然后由连接酶封闭缺口。这个结构变成了共合体。在转座子与复制子之间的连接处有DR。复制可能由宿主编码的酶来完成。这个模型解释了：复制性转座在原来的位置上保留原有的Tn；在新位置上转座子的两端出现正向重复靶序列；转座过程中出现共合体。复制型转座在复制型转座中，整个转座子被复制了，一个拷贝保留在供体的原来部位不变，另一个拷贝即原转座子的拷贝则插入到受体的位点上，供体和受体都有一个转座子的拷贝，所以，通过转座转座子的拷贝数得到了扩增。转座酶和解离酶在转座过程中分别作用于原始转座子和复制转座子。非复制型转座在非复制型转座中，转座子可以直接地从供体的一个位点转移到受体的新位点处，此类转座子的特点是两端具有20bp左右的反向重复序列，特异的转座酶附着于此而使转座子切离下来，整合到另一个位点上。供体在切离后留下的缺口被衔接起来，但往往在衔接处的序列发生改变而产生突变。◎转座子转座的特征☆转座不依赖靶序列的同源性☆转座后靶序列重复☆转座子的插入具有专一性☆转座具有排他性☆转座具有极性效应☆活化临近的沉默基因☆区域性优化◎DNA转座引起的遗传学效应☆可导致突变；☆出现新基因；☆影响插入部位邻近基因的表达，改变宿主表型；☆引起染色体畸变。40年代，BarbaraMcClintock，研究发现：玉米籽粒有色（红、紫），但有一些籽粒出现花斑及条纹，花斑有大有小。早期有颜色者，花斑大，后期有色者，花斑很小.控制元件，可以在基因组内转移，并能改变基因的活性引起功能的改变.◎真核生物的转座子玉米的控制因子果蝇的转座元件自学◆玉米的控制原件