搜索
基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGenecloning第六章•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。•重组产物称为重组体。•基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样）•重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)#转座(transposition)#同源重组(homologousrecombination)#位点特异的重组(site-specificrecombination)异常重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。6.1、同源重组Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构）④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)片段重组体：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录分支移动的过程伴随着DNA的修复•同源重组是减数分裂的原因。•同源重组是由于碱基间的精确配对实现的异源双链与基因交换•同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换。•减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换）•基因转换频率在非对称异源双链区较高。•基因转换也可以在有丝分裂时姐妹染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生•Holliday模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。•在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间DNA的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子P138-139）细菌的基因转移与重组•低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细胞间的基因转移。•具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。•外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。一、接合作用（conjugation)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。F因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、F因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体二、转化作用（transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。分离DNA SH型肺炎双球菌 RH型肺炎双球菌感受态细胞高浓度钙可以诱导感受态例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。三、转导作用（transduction)当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。溶菌感染重组感染细菌噬菌体图15-3转导作用转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)*转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。细菌的细胞融合•由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。•（原生质体融合）细菌的同源重组的酶学机制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点RecBCD有固定切割位点原核生物的重组酶学机制已经比较清楚Chi位点出现几率很高，是RecBCD的靶位点GCTGGTGG3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀chi位点：GCTGGTGG目前发现的重组热点E.coli含1000个、Euk.e、RecBCD切割产生3’单链末端2、RecA蛋白（1）活性a、RecA有单、双链DNA结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型RecA引起的链交换和Holliday结构的生成（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链进入的方向是5’－3‘，双链DNA的互补链是3’－5‘◘RecBCD和RecA的共同作用RecBCD产生游离单链---RECA因子接到重组反应3、原核同源重组的其它蛋白需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点真核生物同源重组机制自学7.2、位点专一性重组（site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组（包括一些基因表达调节、发育过程中DNA重排）噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：◘在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接----产生精确的DNA重排◘都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上二、λphage的整合与切除（溶原和裂解状态）1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）◘E.coliattB含BOB’三序列23bp◘λphageattP含POP’三序列240bp◘核心序列“O”完全一致（同源部分）---位点特异性重组发生的地方◘B,B’,P,P’---臂3、整合过程◘整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）◘整合位点---attB、attP切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶（integraseInt）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）共同作用溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合----核心序列的反向位点（切割位置）----结合在att臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis◘整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB说明-----a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变P1977.3、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintocka)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositet