第六章基因重组与基因工程

第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineer)基因重组(geneticrecombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆(genecloning)将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(geneticengineering)是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。本章主要内容重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用第一节重要的工具酶工具酶基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。一、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。⑴产生5'-粘性末端⑵产生3'-粘性末端-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-3'5'-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-+PstI3'5'⑶产生平(头末)端/钝端5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'+SmaI5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶同裂酶又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。同裂酶——同识同切5'-TTT3'-AAAAAA-3'TTT-5'+AhaⅢDraⅠ5'-TTT3'-AAAAAA-3'TTT-5'同裂酶——同识异切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+KpnI5'-G3'-CCATGGTACC-3'G-5'+Asp718I5'-3'--3'-5'5'-3'--3'-5'5'-3'--3'-5'同尾酶GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5'-3'--3'-5'MboⅠBamHⅠBglⅡ5'-3'--3'-5'5'-A3'-TT-3'A-5'同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ15限制性内切酶的应用通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。二、DNA聚合酶（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶Ⅰ（全酶）DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ应用⑴常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵cDNA第二条链的合成；⑶对DNA3突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化缺口平移*T*T*T*TMg2+DNaseI5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'dATP,dCTP,dGTP[-32P]dTTPE.coliDNAPOLI㈡Klenow片段（DNApol.大片断）Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；聚合酶KlenowDNA[-32P]dNTPα双链DNA粘端5'-外切酶Ⅲ变性+5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'5'5'3'3'标记探针标记末端⑶用于cDNA克隆中第二股链的合成；⑷DNA序列分析。㈢TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。三、逆转录酶(reversetranscriptase)特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。四、DNA连接酶(DNAligase)催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶五、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接3´3´重要的工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异碱基序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成cDNA碱性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶催化3'-端合成同聚尾第二节基因克隆常用的载体载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。本节主要内容载体必须具备的基本条件载体的分类常用的载体一、载体必须具备的基本条件⒈具有独立复制能力⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段⒌可导入受体细胞。二、载体的分类*（一）克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体。有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。（二）表达型载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。三、常用的载体（一）质粒(plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选；3.具有多克隆位点。总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等pBR322质粒①4363bp②含一个复制点③含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).pUC系列质粒由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coli的LacZ基因片断,编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选(二)λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。λ噬菌体两种生长途径（示意图）λ噬菌体感染细菌后的两种生长途径溶菌性生长噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。第三节重组DNA基本原理（DNA重组基本程序包括下列过程）分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定一、目的基因的获取（分）目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。目的基因来源1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应4）人工合成基因（一）制备基因组DNA（基因文库，genomiclibrary）分离、纯化基因组DNA在EDTA等存在下，用蛋白↓RE酶K消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段常用蔗糖梯度离心或电泳↓分离酶切片断；分别与同样RE酶切的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体↓DNA连接酶连接；导入宿主细胞、扩增导入宿主细胞内培养、扩增；↓得到分子克隆混合体用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库）筛选、再扩增，分离、回收。（二）制备cDNA（cDNA文库）分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA与载体连接，导入宿主细胞扩增→构建cDNA文库。（三）聚合酶链反应(PCR)在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNAPol等存在下，构成一个反应体系。经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。（四）人工合成基因应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。（一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段）二、目的基因与载体的连接（接）（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法（一）粘性末端连接将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4D