第十四章基因重组与基因工程

第十四章基因重组与基因工程基因重组：genomicrecombination重组DNA：recombinantDNA第一节、自然界的基因重组•转化：transformation•整合：integration•转导：transduction•转位：transposition转化•转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化转化•病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化整合•整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。•溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。•裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。整合•溶原和裂解可以相互转变。转导•溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。•带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。•来源于宿主的基因称转导基因。转位•转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。•这些游动的基因称为转位子(transposon)。转位第二节、基因工程•基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。•分子水平上操作，细胞水平上表达。•赋予重组DNA以新的生命力。基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。转入GnT-Ⅴ基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-Ⅴ基因转移转移基因克隆分切接转筛载体和目的基因•载体：vector在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。•常用的载体有：质粒、噬菌体、M13噬菌体逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA•载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。质粒•质粒：plasmid环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。•拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。•质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。质粒•pBR322：常用的质粒噬菌体载体•噬菌体、M13噬菌体•易于感染大肠杆菌•噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。•一个切口：插入型载体。•二个切口：置换型载体。噬菌体载体目的基因的来源•直接从染色体DNA中分离：原核生物•人工合成：简单的多肽•从mRNA合成cDNA：真核生物•基因文库：(genelibrary）G文库：用基因组的全部DNA制备。c文库：用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。从mRNA合成cDNA限制性内切酶的应用•限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构•回文结构：palindromeDNA双链具有方向相反顺序一致的结构。•平端：bluntend在同一水平上切断两条链。(钝型末端)•粘性末端：stickyend碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。限制性内切酶的应用•AluI….AGCT…..….AGCT...平端…..TCGA…..….TCGA...•BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因载体和目的基因的连接•人工连接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。•DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。•连接方式：粘端连接方式尾接法粘端连接尾接法重组体的转化•基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。•化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法•物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法•生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体重组体的转化•转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。基因工程的表达体系的发展载体宿主第一代质粒、噬菌体细菌第二代穿梭质粒酵母第三代动植物病毒、昆虫载体组织培养细胞第四代DNA直接导入生殖细胞DNA重组体的筛选与鉴定•根据重组载体的表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型•DNA限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。•利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。DNA重组体的筛选与鉴定•灭活法筛选重组体。提取转化细胞DNA限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组体比较DNA重组体的筛选与鉴定DNA重组体的筛选与鉴定菌落硝酸纤维素滤膜探针X线底片显影平板基因工程策略第三节、基因工程的应用•生命科学研究趋势•基因诊断和基因治疗•基因工程产品的开发和应用生命科学研究趋势•基因的结构与功能研究•基因表达的调控•各种生物大分子之间的识别及结合•了解生命的奥秘基因诊断和基因治疗基因工程产品的开发和应用•基因工程疫苗：安全廉价乙肝疫苗、甲肝疫苗巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、•基因工程生产激素类：胰岛素、生长激素•细胞因子：生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素第五节、聚合酶链反应•聚合酶链反应：PCRpolymerasechainreaction•耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在70~80℃有很高的催化力。•原理：以目的DNA为模板，快速合成大量的DNA，用于检测、制备、研究。第五节、聚合酶链反应•变性：95℃、15s•引物粘合：55℃、30s•引物延伸：72℃、1.5m