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第十四章基因重组和基因工程授课教师郑志竑第一节DNA的重组DNARecombination一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用(conjugation)：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）,这种类型的DNA转移称为接合作用。质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。可接合质粒，如F因子(Ffactor)（二）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。（三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。第二节重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA）应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程----实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。目的：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)（二）工具酶•限制性核酸内切酶•DNA聚合酶I•逆转录酶•T4DNA连接酶•碱性磷酸酶•末端转移酶•TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)：识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠⅡ类酶识别序列特点—回文结构BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口（三）目的基因（又称外源DNA）•cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。•基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。（四）基因载体（克隆载体）：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。二、重组DNA技术基本原理及步骤1、目的基因的获取2、基因载体的选择与构建3、目的基因与载体的拼接4、重组DNA分子导入受体细胞5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）（一）目的基因的获取1、化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNAlibrary）。组织或培养细胞载体mRNAcDNAcDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特征（二）克隆载体的选择常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准：•能自主复制；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。（三）外源基因与载体的连接1、粘性末端连接：•同一限制酶切割位点连接•配伍末端连接2、平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端3、同聚物加尾连接由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。4、人工接头：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。（四）重组DNA导入受体菌：受体菌条件:安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（五）重组体的筛选1、直接选择：抗药性标记选择插入失活法标志补救分子杂交法：原位杂交、Southern印迹原位杂交2、非直接选择法：免疫学方法：如免疫化学方法酶免检测法•重组DNA技术简单概括为：“分、切、接、转、筛”第三节重组DNA技术与医学的关系（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防小结•自然界基因转移伴发重组的形式有多种。•细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。•重组DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一DNA分子。•重组DNA技术的基本过程可概括为“分、切、接、转、筛”。