第十四章基因重组和基因工程

目录生物化学考试前答疑时间：本周四、周五进行。地点：生化楼具体安排请到生化楼看通知。目录DNA重组和重组DNA技术DNARecombinationandRecombinantDNATechnology第21章目录第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequentlyinNature目录DNA的特性：保守性，变异性，流动性DNA重组是指不同的DNA分子断裂并连接，从而产生DNA片段的交换并构成新的DNA分子的过程。目录DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)目录发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式目录Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；一个DNA的一条链断裂；5´3´5´3´5´3´5´3´内切酶(recBCD)5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´目录3´5´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´分支迁移(recA)通过分支移动产生异源双链DNA；目录5´3´3´3´5´3´5´3´内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)目录内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录片段重组体：重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。目录可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒目录（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。目录例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)目录三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。目录λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)都含有相同的核心序列，称为O区，该区由15bp组成：5’GCTTTTTTATACTAA3’3’CGAAAAAATATGATT5’（一）λ噬菌体DNA的整合目录目录反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。目录（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。目录hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。目录H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目录四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。目录插入序列(IS)是从细菌的乳糖操纵子中发现了一段自发的插入序列，阻止了被插入的基因的转录，所以称为插入序列(IS)。转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代10-6一10-7。目录插入序列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列转座•二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列•特有的正向重复序列•一个转座酶（transposase)编码基因目录插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)插入序列的复制性转座目录转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因目录细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录由转座子介导的转座目录第二节重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone目录技术水平：分子克隆(molecularclone)细胞克隆个体克隆（动物或植物）克隆(clone):源于希腊文klone，原意是指以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆目录应用酶学的方法，在体外将目的片段与载体DNA连接，形成成一具有自我复制能力的重组DNA分子，继而在宿主细胞进行复制、扩增，从而获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目录工具酶目的DNA片段载体DNA宿主细胞DNA克隆的基本要素重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类DNA内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：目录Ⅰ型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用；通常其切割位距离认知位可达数千个碱基之远。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：目录Ⅲ型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。Ⅱ型限制酶只具有认知切割的作用。所认知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。目录生理意义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目录来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ5’…G▼AATTC...3’HindⅢ5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ5’…C▼CGG...3’MboⅠ5’…▼GATC...3’NdeⅠ5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ5’