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血红蛋白本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：①样品的处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等一、基本概念及原理原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示二、缓冲溶液在一定范围内，能够抵制对溶液PH值的影响，维持PH不变。1.作用:2.配制:通常由溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得在使用的缓冲液。3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液外界的酸和碱基本1~2种缓冲剂使用比例不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3三、电泳---血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在作用下发生的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有的基团，在一定的PH下，这些基团会带上或。在电场的作用下，这些带电分子会向着的的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A二、实验步骤蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析—去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.血液有哪些成分？1.用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。初次离心后的结果3次洗涤后的结果（2）释放血红蛋白思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作（3）分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次柜式离心机2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）（1）用方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用。将透析袋放入溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是。透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲透析过程动画演示（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）---去除相对分子量较大的杂质蛋白凝胶色谱柱的制作（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。装配好的凝胶柱(3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。②加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④再调整缓冲液面洗脱：⑤收集：待（）接近色谱柱底端时收集顶端样品完全进凝胶层红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动记4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）（5）装槽、点样：拔出梳子→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→在电泳槽中加入缓冲液→点样。（6）电泳：（7)、剥胶、染色及脱色凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。(8)、结果思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。【典例2】(2011·扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有____________功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____________；乙装置中，C溶液的作用是_____________________________。(3)甲装置用于____________，目的是__________________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫____________，是根据_________________分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_____________-_________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。运输磷酸缓冲液洗脱血红蛋白透析(粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小红色的蛋白质接近色谱柱底端观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？教学反馈1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BBBA5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中