多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程美国科学家穆里斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:一、基础知识脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端识别：-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。（1）DNA分子是由的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。4.DNA双螺旋结构特点：（2）与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（A）一定与配对，鸟嘌呤（G）一定同配对。两条反向平行双螺旋脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（二）DNA的复制：1.概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。2.时期：有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。3.场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体4.基本条件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链5.复制特点：a.边解旋边复制b.半保留复制6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行8.复制的意义:DNA分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：细胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链的原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？变性（80～100℃）TaqDNA聚合酶（耐高温）20～30个核苷酸构成DNA或RNA二、PCR（多聚酶链式反应）（一）PCR原理DNA双链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物1和引物2与两条单链的结合PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1～3步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸变性→复性（退火）→延伸（二）PCR的反应过程：（二）PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。DNA母链：解旋酶(条件）：4种脱氧核苷酸：DNA聚合酶（条件）：ATP：引物：缓冲溶液适宜温度（三）PCR反应的条件80—100℃：耐热的DNA聚合酶三、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步骤：（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关光吸收波长／nm2602402202800.10.22、过程①稀释2µLPCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定并计算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50g/mL紫外分光光度计比色杯体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算课堂练习填空题1.PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料合成新链。2.PCR经（）三个阶段为一个循环。DNA互补72℃Tap酶4种dNTP变性、复性、延伸选择题1.PCR反应产物的特异性取决于()A退火温度B引物碱基组成和长度C循环次数D.A+B+CD2.PCR实验的特异性主要取决于（）A.DNA聚合酶的种类B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度C3.做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A.反复洗涤B.不怕外源DNA污染C.高压灭菌D.在-20℃储存4.PCR技术最突出的优点是A.原理简单B.原料易获得C.TaqDNA聚合酶有耐热性D.快速、高效、灵活、易于操作