毒理学研究中的体外细胞毒性评价-刘涛

第26卷第3期2014年3月Vol.26,No.3Mar.,2014生命科学ChineseBulletinofLifeSciences文章编号：1004-0374(2014)03-0319-06DOI:10.13376/j.cbls/2014047收稿日期：2013-07-11；修回日期：2013-08-11基金项目：北京市教委科技发展计划重点项目(KZ2012-11417041)*通信作者：E-mail:[e-mail]毒理学研究中的体外细胞毒性评价刘　涛1，郭　辰2，赵晓红2*(1首都师范大学生命科学学院，北京100048；2北京联合大学功能食品研究院，北京100191)摘　要：体外细胞毒性评价作为传统动物模型毒性评价的替代方法正在得到越来越多的研究和应用，而其向高通量阶段的迈进则为新毒物和新药物的检测与目的物的筛选提供了更加快捷、高效的手段。将对体外细胞毒性评价常用细胞类型、体外细胞毒性评价的指标，及其检测技术方法的研究现状、进展和存在问题进行阐述，希望能为相关的研究提供一定的参考。关键词：毒理学；体外试验；细胞毒性评价；高通量筛选中图分类号：Q256；R99　　文献标志码：AInvitrocytotoxicityevaluationintoxicologyLIUTao1,GUOChen2,ZHAOXiao-Hong2*(1SchoolofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China;2ResearchInstituteforScienceandTechnologyofFunctionalFoods,BeijingUnionUniversity,Beijing100191,China)Abstract:Invitrocytotoxicityevaluation,asanalternativeoftraditionaltoxicityevaluationusinganimalmodels,hasbeenwidelystudiedandapplied.Thedevelopmentofcell-basedhigh-throughputdetectingandscreeningassayswillprovidefastandefficientmeansfordetectingnewtoxicsubstancesanddrugsandscreeningtargetingredients.Thecurrentresearchstatus,scientificprogress,andexistingproblemsofcommonlyusedcelltypes,differenttestindexesandmethodsforinvitrocytotoxicityassessmentsarereviewed,whichwillprovidesomereferenceforrelatedresearch.Keywords:toxicology;invitroassay;cytotoxicityevaluation;high-throughputscreening毒性评价的传统方法主要是动物体内实验，通过解剖检查、称量重量、计算脏器指数、血液生化学检查及病理形态学检查等来发现受试物的器官毒性，即利用啮齿类动物和非啮齿类动物进行不同时间段的生物测定。虽然这种方法在评估化学物对人类潜在危害的实际应用中发挥了重要的作用，但随着科学技术的发展，其局限性也逐渐显露出来。细胞试验正是在这一基础上发展起来的。近年来，体外细胞毒性评价由于其周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展。目前在体外试验很难监控全身生理效应的前提下，大多数试验都是测定细胞水平的效应，即体外细胞毒性。在限定条件下，可根据药物代谢动力学模型将体外细胞毒性检测的结果外推并应用到体内研究中[1]。相对于复杂的体内反应，所有体外细胞毒性试验都是简化了的监测事件，但由于其经济、快速、易于量化和可重复性好，且符合替代(replacement)、减少(reduction)和优化(refinement)，即3R的原则[2]，它不仅提高了毒理学检测的效率，减少了动物的使用，而且将会使基于人类细胞或细胞系的体外毒理学检测途径的定量自动化高通量检测与筛选得到更广泛的应用[1]。随着社会科学技术的发展和人类需求的不断扩大，新的药品、化学佐剂、食品添加剂、化工原料以及环境污染物等化学物不断地被发现和制造出来，并且要求快速得到实际的检测和应用，以满足∙技术与应用∙生命科学第26卷320人类的需求[3]。简单的检测评估与筛选手段已不能满足这一需求，这就对检测评估技术和筛选方法提出新的挑战。而融合多种新技术和新方法并应用简便快速的体外试验对大量化学物进行检测与筛选的高通量体外细胞毒性评价，恰好符合这一要求，并且近年来高通量体外细胞毒性评价的快速发展使问题正在得到逐步解决。目前，高通量细胞毒性评价已成为毒理学和药理学等领域的研究热点，并且在理论研究和实际应用中都发挥着重要的作用。因此，本文对细胞毒性评价相关方面的发展及其最新的研究现状进行介绍，希望能对相关领域的研究提供一定的参考信息。1　体外细胞毒性评价常用细胞类型体外细胞毒性评价所用的细胞根据受试物的不同而不同，但其基本原则是一致的，即能够尽量精确地反映毒物毒性、易于培养、连续操作性强等。在体外细胞毒性评价中，受试物多与高等生物，尤其是与人密切相关。因此，体外细胞毒性评价常用的细胞主要为直接来自人体组织的细胞，或与人类亲缘关系较近的模式生物的细胞，常用的细胞株/系类型见表1，但在环境毒物体外细胞毒性评价中，也常用到一些低等生物细胞，如酵母[4]、单细胞藻类[5]等。来源于正常组织的细胞是体外细胞毒性评价中常用的细胞类型，其功能特点和结构特性使体外细胞毒性评价更具针对性和明确性，更易于探明毒物引起细胞损伤的作用机制。Shoham等[6]利用来自金色仓鼠胚胎的正常细胞测定刀豆蛋白A(concan-avalinA,ConA)的细胞毒性，并将其与转化后的细胞相比较，以研究ConA对体内肿瘤产生的抑制作用。利用正常细胞可检测药物对生物体特定器官的损伤作用。Jo等[7]利用大鼠、小鼠、恒河猴和人的肝细胞评估肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)诱导正常细胞凋亡的敏感性，结果显示TRAIL可诱导人正常肝细胞的凋亡，经TRAIL处理10h，细胞凋亡和死亡比率达到60%以上，且出现明显的细胞质收缩、caspases活化和DNA片段化等典型的凋亡特征，而其他几个物种的肝细胞却没有出现以上现象。这些结果表明，细胞对TRAIL的敏感性存在种间差异，若将TRAIL应用于人类癌症治疗，可能会出现肝毒性。来源于肿瘤组织的细胞是体外细胞毒性评价中另一种常用的细胞类型，它们可在体外培养条件下无限地增殖传代，这使其在体外细胞毒性评价中得到广泛的应用。Davoren等[8]利用A549细胞评估单壁碳纳米管(singlewalledcarbonnanotubes,SWCNT)对肺细胞的细胞毒性，从而评价其对人体的毒性，结果显示SWCNT对A549细胞的急性毒性非常低。Nakagawa等[9]表1体外细胞毒性评价中常用细胞株/系类型来源细胞株/系形态学起源种属年龄倍性来源于正常组织的有限细胞系IMR-90成纤维细胞肺人胚胎期二倍体MRC-9成纤维细胞肺人胚胎期二倍体WI-38成纤维细胞肺人胚胎期二倍体MRC-5成纤维细胞肺人胚胎期二倍体来源于正常组织的连续细胞系MDCK上皮样细胞肾家犬成年非整倍体L929成纤维细胞皮下/脂肪小鼠成年非整倍体3T3-L1成纤维细胞胚胎Swiss小鼠胚胎期非整倍体CHO-K1成纤维细胞卵巢中国仓鼠成年二倍体COS成纤维细胞肾非洲绿猴成年非整倍体Vero上皮样细胞肾非洲绿猴成年非整倍体H9c2成肌细胞心脏大鼠胚胎期二倍体来源于肿瘤组织的连续细胞系A549上皮细胞肺人成年非整倍体Caco-2上皮细胞结肠人成年非整倍体Hela上皮细胞子宫颈人成年非整倍体HepG2上皮样细胞肝细胞瘤人成年非整倍体HL-60悬浮细胞髓系白血病人成年非整倍体MCF-7上皮细胞乳腺癌胸膜人成年非整倍体刘　涛，等：毒理学研究中的体外细胞毒性评价第3期321利用人乳腺癌MCF-7细胞检测二苯甲酮在细胞内代谢及其代谢物对细胞的影响，结果表明二苯甲酮可在细胞内代谢，并且其代谢物具有雌激素作用，可刺激MCF-7细胞的增殖。此外，体外细胞毒性评价中也常用到其他类型的细胞，如具有回复突变性状的中国仓鼠肺细胞株V79被用于检测药物遗传毒性，以评价其安全性；梨形四膜虫(Tetrahymenapyriformis)被用于环境遗传毒理学，以研究环境诱变物等[10]。2　体外细胞毒性评价的指标及其检测技术方法体外细胞毒性评价指标一般是基于细胞的数量、形态、结构及生理特征来评价细胞毒性变化特征的指标，并针对不同的指标建立了不同的检测方法。2.1　细胞水平2.1.1　细胞生长抑制细胞经受试物作用后，会出现因毒性作用而生长抑制或死亡，或者因激活作用而增殖速率加快的现象，这直接反映在细胞数量的变化上。检测细胞数量，计算变化比率即可得出受试物对细胞的效应。细胞数量可通过仪器检测绝对数量，计算细胞的增殖或死亡率；也可通过化学试剂检测细胞活性，计算细胞的激活或抑制率。活细胞计数仪可对受试细胞群的活细胞进行计数，但应用较多的是化学比色法，如MTT法[11]及类似原理的WST-1法[12]、CCK8法[13]、MTS法[14]和XTT法[15]等，利用细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶将检测试剂内的唑盐还原为甲臜(formazan)，甲臜的生成量与琥珀酸脱氢酶的活性呈正相关，琥珀酸脱氢酶活性又反映了细胞活性，因此，对甲臜溶液进行比色测定即可求得受试物对细胞的激活或抑制率；结晶紫染色法[12]和中性红染色法[12]等都是利用活细胞特定的生理条件(局部酸性)以对其特定的部位(细胞核和溶酶体)进行染色，从而达到对活细胞进行计数的目的，它们都可测得受试细胞中活细胞的相对数量；而ATP检测法[11]和磺酰罗丹明B(sulforhodamineB,SRB)检测法[16]对细胞相对数量的测定则更加灵敏且可重复性强。在这些细胞增殖测定方法的基础上，就可以建立细胞增殖筛选模型，从而可从正或负相关性评价受试物对细胞的效应。Wodnicka等[17]基于对细胞整体状况变化的检测，建立了一种新型的荧光-氧生物传感器技术平台，该技术适用于许多应用领域的药物开发和检测，特别是基于细胞的检测，如可用于检测细胞的活力、增殖和死亡，也适合于研究细胞在增殖或毒性刺激时的动力学反应。2.1.2　细胞膜完整性细胞经毒物作用后，膜结构会受到破坏，出现细胞膜完整性受损或渗漏现象。这一指标可通过外源物的渗入或细胞内源物的渗出来检测。台盼蓝拒染率检测[11,18]利用台盼蓝可透过受损细胞膜而无法透过完整细胞膜的特点，对膜受损细胞进行染色，从而通过镜检计算出细胞膜受损的比率。乳酸脱氢酶漏出率检测[19]是利用胞浆乳酸脱氢酶可通过受损细胞膜漏出的特点，通过检测细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性来评价细胞膜受损程度。而通过特定的荧光物质与细胞膜或细胞内分子结合的荧光检测法则具有更高的敏感性和稳定性。2.1.3　细胞代谢活性细胞代谢活性检测可从细胞的能量代谢、氧化还原状态和生物大分子合成状态三个方面进行。细胞能量代谢最直接的体现就是ATP的生成与消耗速度，通过特异性试剂或专门的ATP检测试剂盒检测细胞内ATP的状态和含量，即可得知细胞的能量代谢状态[20]。细胞氧化还原状态多以细胞内还原性物质或氧化产物的多少来衡量，如细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量[21]，脂质过氧化产物，如4-羟基壬烯酸和丙二醛的生成量等。此外，细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)酶系对细胞内