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第二节工具酶切接转检增完整的基因克隆过程（一）基本知识一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease,RE）1、定义：指一类能够识别双链DNA分子中的某特种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。2、来源:原核生物细菌的限制和修饰系统（R/M体系）限制性核酸内切酶•1•1•1EcoliC•10-4•1•10-4EcoliB•10-4•10-4•1EcoliK•λC•λB•λKEcoli菌株λ噬菌体感染率RE将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）3.性质:内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。内切酶限制性核酸内切酶×√4.功能:自我保护作用限制性核酸内切酶细菌的限制和修饰系统（R/M体系）•1•1•1EcoliC•10-4•1•10-4EcoliB•10-4•10-4•1EcoliK•λC•λB•λKEcoli菌株λ噬菌体感染率I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。（二）限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）酶结构1.I型限制性内切酶如EcoB和EcoK。三亚基双功能酶：R:限制酶亚基M:甲基化酶亚基S:识别DNA序列亚基（2）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（3）切割位点类型Ⅰ：大型的多亚基的蛋白质。具有内切酶的活性、具有甲基活性化酶的活性。具限制和修饰两种体系，切割位点基本上是随机。因此Ⅰ型内切酶在DNA重组研究工作中并没有什实际用处。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）酶结构相反方向结合的同源二聚体内切酶与甲基化酶分开2.II类限制性内切酶分离的第一个酶是HindⅡ（2）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文对称序列--旋转对称序列，反向重复序列）。与DNA的来源无关。2.II类限制性内切酶EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（3）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。（4）粘性末端含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG②3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC①连接便利粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。识别位点和切点完全相同称同裂酶。①同裂酶（Isoschizomers)：如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’如XmaI和SmaI②同位酶：识别位点相同，但切点不同。（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式③同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A（6）II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATG3‘…CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC3‘…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCAAGCGTA…5’BamHISmaI对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥3.III类限制性内切酶二亚基双功能酶，也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸），这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG异源三聚体ATPMg2+SAMTGAN8TGCT距识别序列1kb处AACN6GTGC随机性切割限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列单功能识别序列内或附近特异性切割双功能异源二聚体ATPMg2+SAMAGACCCAGCAG距识别序列下游24-26bp处1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：（三）限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度（四）影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量1mgDNA用10U酶③延长反应时间④扩大反应体积（20ml）一般采取大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。如高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，能切割与识别序列相似的序列。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（*）活性4.缓冲液(Buffer)EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！•EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。使用的时候要特别注意！（五）限制性内切酶对DNA的消化1.内切酶与识别序列的结合模式1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2.完全消化12341234只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。3.局部消化123414大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。4.限制酶酶切反应的终止5.几种常用限制酶识位点（一）功能：保护宿主DNA不被相应的限制酶切割。二、甲基化酶在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。（二）甲基化酶的种类Dam甲基化酶GATC，A-N6甲基腺嘌呤BamHⅠ:GGATCCDcm甲基化酶CCAGG，CCTGG,C-5甲基胞嘧啶EcoRⅡ：CCAGG（三）甲基化对限制酶切的影响基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam或Dcm甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。修饰酶切位点三、DNA连接酶(DNAligase)1、定义催化双链DNA片段靠在一起的3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。OHP5`3`